大黃酸、川芎嗪和人參皂甙Re-Rg1對(duì)氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的早期表現(xiàn),是一種彌散性病變,是人類(lèi)心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。因此,本研究探討了大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl對(duì)氧脅迫狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVEC)的保護(hù)作用,旨在篩選干預(yù)血管內(nèi)皮功能障礙的功效成分,從多路徑探討其作用的分子生物學(xué)機(jī)理,為預(yù)防和治療血管內(nèi)皮功能障礙提供理論依據(jù)。
　　 本研究采用H2O2誘導(dǎo)建

2、立內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型。將細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2損傷組和2～5個(gè)藥物組。測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactic aciddehydrogenase,LDH)釋放率、超氧化物歧化酶(super oxide dlsmutase,SOD)、一氧化氮合酶(nitrogen oxide synthase,NOS)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)的活性,丙二醛(malondialdehyde,

3、MDA)、NO生成量的變化趨勢(shì);通過(guò)MTT、激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估正常和氧化損傷HUVEC的存活率、細(xì)胞形態(tài)、凋亡、膜電位等指標(biāo);利用qRT-PCR和雙向電泳分析各實(shí)驗(yàn)組的蛋白和基因水平(Caspase3,8,9和eNOS);HPLC測(cè)定藥物分子在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝,建立HPLC測(cè)定藥物分子在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝的快速測(cè)定方法。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),從整體水平分析所用藥物對(duì)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。其具體結(jié)果如下:
　　

4、1.采用H2O2誘導(dǎo)成功地建立了血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型,激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果表明,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,產(chǎn)生了凋亡小體,說(shuō)明H2O2可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而使細(xì)胞受到損傷。
　　 2.當(dāng)大黃酸和川芎嗪濃度分別達(dá)到32μmol/L和160μmol/L時(shí),會(huì)抑制HUVEC的存活,細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變,呈現(xiàn)細(xì)胞毒性;人參皂甙Rgl/Re達(dá)到250μmol/L時(shí),未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性。
　　 3.應(yīng)用HPLC測(cè)定細(xì)胞培

5、養(yǎng)液所含大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl的濃度,發(fā)現(xiàn)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),上述物質(zhì)的濃度均有不同程度的下降。說(shuō)明這些物質(zhì)能夠進(jìn)入細(xì)胞從而行使其保護(hù)細(xì)胞免受損傷的功能。
　　 4.大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl均能逆轉(zhuǎn)或者消減H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的損傷,能使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)——L,DH釋放率降低,細(xì)胞的SOD和GSH-Px活性升高,細(xì)胞的清除自由基的能力上升,細(xì)胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量減少。說(shuō)明上述物質(zhì)可能

6、是通過(guò)抗氧化機(jī)制保護(hù)了細(xì)胞免受氧化損傷;
　　 5.H2O2誘導(dǎo)了NO分泌量、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidesynthase,eNOS)活性和eNOS mRNA表達(dá)水平下降(p＜0.05),而大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl能減弱H2O2誘導(dǎo)的eNOS活性和eNOS mRNA表達(dá)水平的下降。表明上述物質(zhì)可提高eNOS活性進(jìn)而增加NO的分泌量,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。這可能是大黃酸、川芎

7、嗪、人參皂甙Re/Rgl保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的另一個(gè)作用機(jī)制;
　　 6.通過(guò)流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡,測(cè)定了細(xì)胞膜電位、細(xì)胞凋亡數(shù)量、實(shí)時(shí)觀察了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化,發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl能夠減少H2O2誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù),恢復(fù)細(xì)胞膜電位,降低細(xì)胞核和細(xì)胞胞漿的Ca2+濃度,顯著下調(diào)Caspase3,8,9的活性和mRNA的表達(dá),說(shuō)明他們能夠通過(guò)與線粒體誘導(dǎo)途徑相關(guān)的Caspas

8、e依賴(lài)的抗凋亡機(jī)制保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷。
　　 7.蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明,H2O2誘導(dǎo)了7個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)水平發(fā)生了上調(diào),這些蛋白可能是通過(guò)氧化、促凋亡、影響能量代謝、脂肪代謝和DNA合成等方式導(dǎo)致了細(xì)胞損傷。人參皂甙Re可以使5個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生了上調(diào),這些蛋白主要是通過(guò)抗氧化、降低外周血管阻力等過(guò)程來(lái)防止細(xì)胞的氧化損傷。
　　 綜上所述,大黃酸、川芎嗪、人參皂甙Re/Rgl主要是通過(guò)抗氧化、抗凋亡、啟動(dòng)NOS-