HA納米載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)hGM-CSF基因的HepG2疫苗誘導(dǎo)PBMC的抗瘤效應(yīng)觀察.pdf

1、目的:腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移主要是因機(jī)體的抗腫瘤免疫功能低下而產(chǎn)生的,表現(xiàn)為免疫逃逸和免疫耐受;腫瘤疫苗通過(guò)增強(qiáng)腫瘤的抗原性而重建機(jī)體的免疫功能,已成為腫瘤防治的一種新療法,而將hGM-CSF基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞可使細(xì)胞的免疫原性大大增加。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HA納米顆粒攜帶hGM-CSF基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染,制備成轉(zhuǎn)hGM-CSF基因的HepG2疫苗,體外觀察轉(zhuǎn)基因 HepG2疫苗的抗瘤效應(yīng),為基因修飾的肝癌疫苗的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　

2、1.轉(zhuǎn)基因的HepG2細(xì)胞疫苗的制備與鑒定:HA納米載體攜 GM-CSF基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,RT-PCR方法檢測(cè) GM-CSF基因 mRNA的表達(dá),采用 ELISA法檢測(cè)hGM-CSF蛋白的分泌,再將其經(jīng)亞致死劑量的放射線后,制備成攜帶hGM-CSF基因的HepG2細(xì)胞疫苗。同時(shí)制備野生型HepG2疫苗。
　　2.外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的分離與誘導(dǎo):取健康人外周血,密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),分別與不

3、同濃度的轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗及野生型HepG2疫苗共同培養(yǎng),篩選最佳誘導(dǎo)濃度。
　　3.PBMC分組:根據(jù)誘導(dǎo)細(xì)胞的不同將PBMC分為五組,轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗組、野生型HepG2疫苗組A、野生型HepG2疫苗組B、空白對(duì)照組A、空白對(duì)照組B,其中野生型HepG2疫苗組A為單純的野生型HepG2疫苗誘導(dǎo),野生型HepG2疫苗組B為野生型HepG2疫苗加hGMCSF因子誘導(dǎo);空白對(duì)照組A、空白對(duì)照組B加等量培養(yǎng)基,在IL-2存在或不

4、存在的條件下共同培養(yǎng)。
　　4.各組PBMC體外抗瘤效應(yīng)的觀察:選擇最佳誘導(dǎo)濃度,各組PBMC在誘導(dǎo)后,流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+、CD8+細(xì)胞比例的變化,ELISA法測(cè)定INF-γ的分泌,WST法測(cè)定各組PBMC的殺傷活性。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備轉(zhuǎn)基因的HepG2細(xì)胞疫苗和野生型HepG2疫苗。RT-PCR顯示hGM-CSF基因在HepG2細(xì)胞中已整合及穩(wěn)定表達(dá)。ELISA檢測(cè)出轉(zhuǎn)入hGM-CSF基因的HepG2

5、細(xì)胞能穩(wěn)定分泌hGM-CSF,其分泌量為197.28±38.53ng/10E6cells每24 h。
　　2.成功分離PBMC,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活性均在95％以上。在I:E值為1:20時(shí),轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗和野生型HepG2疫苗誘導(dǎo)PBMC增殖的能力均有最大效應(yīng)(P<0.05)。
　　3.I:E值為1:20時(shí),流式細(xì)胞結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗組PBMC中CD4+百分率為57.49±0.98%,CD8+細(xì)胞百分率為39.

6、06±2.01; ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗組PBMC中INF-γ分泌量為1989.76±254.21pg/ml;WST結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因HepG2疫苗組PBMC在不同的效靶比的條件下對(duì)HepG2的殺傷率分別為55.32±6.29、64.85±7.31和79.37±6.02,均高于其他各組(野生型HepG2疫苗組A、野生型HepG2疫苗組B、空白對(duì)照組A、空白對(duì)照組B)PBMC(P<0.05)
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)