白藜蘆醇納米乳的研制及誘導(dǎo)體外HepG2凋亡的研究.pdf

1、目的：制各白藜蘆醇納米乳，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；探討其對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株HepG2的誘導(dǎo)凋亡作用和對(duì)大鼠肝細(xì)胞的毒性。 方法：(1)選用非離子型表面活性劑蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚氧乙烯醚(40)氫化蓖麻油(RH-40)、Tween80、Span80，采用三元相圖法篩選處方并考察影響納米乳形成的影響因素，對(duì)各處方的理化特性、穩(wěn)定性進(jìn)行考察。(2)以肉豆蔻酸異丙酯(IPM)為油相、無水乙醇為助表面活性劑，采用偽三元相圖從E

2、L-40和RH-40中篩選最合適的表面活性劑來制備白藜蘆醇納米乳。用紫外分光光度法建立白藜蘆醇含量檢測(cè)方法，并對(duì)白藜蘆醇納米乳的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。(3)MTT法檢測(cè)白藜蘆醇納米乳對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性；克隆形成試驗(yàn)觀察其對(duì)單個(gè)細(xì)胞增殖的影響；并測(cè)定其對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響；通過倒置顯微鏡、HE染色、電子掃描顯微鏡觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期影響；通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶

3、、乳酸脫氫酶的含量，檢測(cè)其對(duì)HepG2細(xì)胞膜通透性的影響。(4)消化法培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，MTT法檢測(cè)白藜蘆醇納米乳對(duì)正常大鼠肝細(xì)胞的毒性，通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的含量，檢測(cè)其對(duì)正常肝細(xì)胞膜通透性的影響。 結(jié)果：(1)表面活性劑、助表面活性劑、油相、表面活性劑和助表面活性劑的比值(Km)等對(duì)納米乳的形成均有影響?？瞻准{米乳平均粒徑為10.7±1.2nm，各處方的納米乳粒徑均小于100nm。高速離心和恒

4、溫加速試驗(yàn)表明，各處方經(jīng)13,000 rpm,30min、40±2℃及相對(duì)濕度75±5％的條件下放置6個(gè)月均能保持外觀澄清透明，無分層和絮凝現(xiàn)象。(2)以RH-40為表面活性劑制備的白藜蘆醇納米乳的納米乳區(qū)大于以EL-40為表面活性劑制備的納米乳區(qū)；納米乳形狀為球形，平均粒徑為17.6±0.9 nm，大小在1～100nm之間，且分布均勻；白藜蘆醇納米乳樣品中白藜蘆醇的濃度為6.184±0.143mg．mL-1；在2～12μg．mL-1內(nèi)

5、，線性關(guān)系良好，r=0.9990，平均回收率為95.8％，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于0.25％；白藜蘆醇納米乳經(jīng)離心試驗(yàn)和加速試驗(yàn)均能保持外觀、pH值和含量穩(wěn)定；納米乳基質(zhì)對(duì)具有很好的保護(hù)作用。(3)白藜蘆醇納米乳與白藜蘆醇原料藥相比，當(dāng)白藜蘆醇濃度大于8 mg．L-1作用HepG2細(xì)胞48h后，細(xì)胞抑制率顯著增加(p<0.05)，IC50分別為：6.5mg．L-1和24.2mg．L-1；經(jīng)4mg．L-1白藜蘆醇原料藥和4mg．L-

6、1白藜蘆醇納米乳處理人肝癌細(xì)胞系HepG23d后，細(xì)胞數(shù)量顯著少于正常培養(yǎng)的細(xì)胞(p<0.01)，在4d后，白藜蘆醇原料藥處理的細(xì)胞數(shù)顯著多于白藜蘆醇納米乳處理后的細(xì)胞數(shù)(P<0.01)；8mg．L-1白藜蘆醇納米乳作用HepG2細(xì)胞24h，細(xì)胞形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)明顯的凋亡特征，使細(xì)胞阻滯在S/G2期，但各組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的含量未有明顯的變化。(4)白藜蘆醇納米乳與白藜蘆醇原料藥對(duì)正常大鼠肝細(xì)胞沒有明顯的毒性作用，各組谷丙