七氟醚缺血后處理對大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷保護(hù)的機理研究.pdf

1、目的：
　　 1、觀察七氟醚缺血后處理對健康成年大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，研究活性氧（ROS）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）可能的作用；
　　 2、觀察七氟醚缺血后處理對慢性心梗大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，研究蛋白激酶B（PKB/Akt）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）在其中的可能作用；
　　 3、比較七氟醚缺血預(yù)

2、處理、七氟醚缺血后處理及七氟醚缺血預(yù)處理聯(lián)合七氟醚缺血后處理3種方式對健康成年大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷保護(hù)效果及相關(guān)機制；
　　 4、系統(tǒng)評價和薈萃分析七氟醚、異丙酚用于行冠脈搭橋手術(shù)時對患者的心肌保護(hù)效果。
　　 方法：
　　 1、大鼠心臟離體，以K-H緩沖液灌注，全心缺血30 min后復(fù)灌60 min建立缺血-再灌注損傷模型。七氟醚缺血后處理的心臟于缺血后復(fù)灌最初15 min以3％七氟醚飽和的K-H緩沖液

3、灌注。分別單獨給予或與七氟醚同時給予ROS清除劑NAC（4mM）或ERK1/2阻斷劑PD98059（20μM），用以評價ROS及ERK1/2在七氟醚缺血后處理中的作用。比較各組間血流動力學(xué)、心肌梗死面積、冠脈流出液中乳酸脫氫酶（LDH）及肌酸肌酶.MB（CK-MB）水平。同時，測定各組缺血30 min復(fù)灌60 min后心肌丙二醛（MDA）含量以反映氧化應(yīng)激損傷程度。Western blotting測定ERK.1/2的磷酸化情況。測定心肌

4、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量以反映mPTP的開放情況。
　　 2、大鼠在體結(jié)扎冠狀動脈左前降支（LAD）建立梗死模型，6周后開胸取心，以K-H緩沖液離體灌注，全心缺血30 min后復(fù)灌60 min建立缺血-再灌注損傷模型。七氟醚缺血后處理組的心臟在缺血后復(fù)灌最初15 min以3％七氟醚飽和的K-H緩沖液灌注。為評價PKB/Akt及ERK1/2在七氟醚缺血后處理中的作用，分別單獨給予或與七氟醚同時給予兩激酶的特異性抑制劑L

5、Y294002（15 gM）及PD98059（20μM）。比較各組間血流動力學(xué)、心肌梗死面積、冠脈流出液中LDH及CK-MB水平。以Western blowing測定復(fù)灌15 min時PKB/Akt及ERK1/2的磷酸化情況。測定心肌中NAD+含量以反映mPTP的開放情況。
　　 3、健康成年大鼠離體心臟經(jīng)緩沖液平衡期灌注10 min后，隨機分為4組：對照（CTRL）組：繼續(xù)灌注25 min后，行30 min全心缺血，后復(fù)灌12

6、0 min，實驗過程中未給予其它藥物干預(yù)；七氟醚缺血預(yù)處理（SpreC）組：缺血前，給予3％七氟醚15 min后沈出10 min行預(yù)處理；七氟醚缺血后處理（spostC）組：缺血后復(fù)灌最初15 min給予3％七氟醚行后處理；七氟醚缺血預(yù)處理聯(lián)合七氟醚缺血后處理（SpreC+SpostC）組：聯(lián)合使用SpreC和SpostC組的實驗方案。比較組間相同時點及組內(nèi)不同時點間的血流動力學(xué)指標(biāo)。實驗結(jié)束后，用TTC染色法比較組間心肌梗死面積。測定

7、平衡期及復(fù)灌120 min時冠脈流出液中的LDH和CK-MB作為心肌損傷指標(biāo)。蛋白印跡法（WB）觀察PKB/Akt和ERK1/2在實驗中不同時點的動態(tài)變化趨勢。通過測定復(fù)灌15 min心肌NAD+含量以反映mPTP的開放程度。此外，復(fù)灌120 min時左室心肌取材行全基因芯片表達(dá)譜分析。
　　 4、計算機檢索Pubmed、EMBASE等國外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫及中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國期刊網(wǎng)等中文數(shù)據(jù)庫，并配合手工檢索所有文獻(xiàn)全文，由

8、兩位作者分別進(jìn)行有關(guān)資料的提取，主要包括患者一般情況、手術(shù)情況及體外循環(huán)后心排指數(shù)（CI）、術(shù)后肌鈣蛋白Ⅰ水平（cTnI）、術(shù)后機械通氣時間、正性肌力藥物支持等指標(biāo)參數(shù)、ICU和住院時間、死亡率、心肌梗死、心肌缺血和心房纖顫發(fā)生率等終點事件，隨后用RevMan5.0進(jìn)行薈萃分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、與ISCH組相比，復(fù)灌之初給予3％七氟醚可顯著改善心功能（增加左室發(fā)展壓力、左室最大收縮/舒張速率、冠脈流量、心率，并

9、降低左室舒張末期壓力）、降低心肌梗死面積及減少LDH及CK-MB釋放（P<0.05）。七氟醚的心肌保護(hù)作用同樣表現(xiàn)在降低缺血-再灌注損傷后心肌的MDA含量（P<0.05）。然而，給予NAC或PD98059不僅可消除上述保護(hù)作用，而且可以抑制七氟醚增強ERK1/2磷酸化及抑制mPTP開放的保護(hù)作用（P<0.05）。
　　 2、與缺血-再灌注損傷組相比，復(fù)灌之初給予3％七氟醚可顯著改善心功能（增加左室發(fā)展壓力、左室最大收縮/舒張速率

10、、冠脈流量、心率、并降低左室舒張末期壓力）、降低心肌梗死面積及減少LDH及CK-MB釋放（P<0.05）。然而，給予LY或PD分別抑制PKB/Akt或ERK1/2磷酸化后可消除上述保護(hù)作用（P<0.05），而且導(dǎo)致心肌NAD+含量降低（P<0.05）。
　　 3、與CTRL組相比，七氟醚處理（SpreC2、SpostC及SpreC+SpostC）的3組心臟缺血-再灌注損傷后心功能改善（表現(xiàn)為LVDP、+dp/dt、-dp/dt、

11、CF和HR的升高及LVEDP的降低）、梗死面積降低、LDH和CK-MB釋放減少（P<0.05）。就上述指標(biāo)在3個七氟醚處理組間行組內(nèi)比較可見：SpreC+SpostC的保護(hù)效果最佳（P<0.05），而SpreC和SpostC間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。WB分析顯示，CTRL組心臟缺血-再灌注后PKB/Akt和ERK-1/2的磷酸化程度較平衡期增強（P<0.05）；SpreC和SpreC+SpostC組心臟均出現(xiàn)雙時相的PKB

12、/Akt和ERK-1/2的磷酸化增強（分別出現(xiàn)在預(yù)處理和后處理后）；與此不同的是SpostC組僅出現(xiàn)單時相的PKB/Akt和ERK-1/2磷酸化增強（后處理后）。組間比較：SpreC2+SpostC組中先后施行的SpreC和SpostC對PKB/Akt及ERK-1/2的磷酸化增強作用在復(fù)灌15 min和120 min出現(xiàn)累加。CTRL組復(fù)灌15 min時心肌NAD+含量最低（P<0.05），SpreC+SpostC組最高（P<0.05）

13、，提示SpreC和SpostC抑制mPTP開放的作用也可累加。以Agilent大鼠全基因表譜芯片對3種七氟醚缺血處理方式后的心肌和未經(jīng)處理的缺血-再灌注損傷心肌進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，僅有少數(shù)基因同時受SpreC、SpostC和SpreC+SpostC同向調(diào)節(jié)。
　　 4、薈萃分析共納入13項前瞻性隨機對照研究（RCT），包括696例患者，其中七氟醚組402入，異丙酚組294人。結(jié)果顯示：兩組患者術(shù)后機械通氣時間、正性肌力藥物支持

14、、死亡率、心梗和房顫發(fā)生率等方面的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與異丙酚組相比，七氟醚組患者體外循環(huán)后CI增高（P=0.003），術(shù)后cTnI降低（P<0.00001），術(shù)后心肌缺血發(fā)生率降低（P=0.02），ICU和住院時間縮短（P=0.24和P=0.21）。
　　 結(jié)論：
　　 1、3％七氟醚缺血后處理通過ROS-ERK1/2-mPTP信號通路可為健康大鼠離體心臟的缺血-再灌注損傷提供保護(hù)。
　　 2、

15、3％七氟醚缺血后處理通過激活PI3K-PKB/Akt及MEK1/2-ERK1/2途徑，并抑制mPTP開放，從而為慢性梗死大鼠離體心臟的缺血-再灌注損傷提供保護(hù)。
　　 3、3％的SpreC和SpostC對離體心臟的心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)效果相當(dāng)，主要表現(xiàn)在改善心功能、降低梗死面積、減少心肌損傷、促進(jìn)保護(hù)性激酶活化及抑制mPTP開放。聯(lián)合應(yīng)用SpreC和SpostC則能夠提供額外的心肌保護(hù)效果。三種七氟醚缺血處理后心肌基因表達(dá)