用四種體外試驗(yàn)方法評(píng)價(jià)長(zhǎng)春新鹼誘發(fā)的人淋巴細(xì)胞的遺傳損傷.pdf

1、1.目的：抗腫瘤藥物是通過殺死增生細(xì)胞和破壞細(xì)胞分裂來阻止腫瘤生長(zhǎng)的化學(xué)物,然而,許多抗腫瘤藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證明具有致癌性、致突變性和致畸性。目前檢測(cè)細(xì)胞遺傳損傷的方法很多,常用的有染色體畸變、姐妹染色單體交換(SCE)、微核試驗(yàn)(MN)、彗星試驗(yàn)和基因突變?cè)囼?yàn)等方法。長(zhǎng)春新鹼(VCR)是一種抗有絲分裂的抗腫瘤藥物,并被IARC列為10種對(duì)人致癌的抗癌藥物中的一種(IARC,1987,1990)。長(zhǎng)春新鹼系紡錘體毒物,能影響有絲

2、分裂和減數(shù)分裂,誘發(fā)染色體多倍體、染色體畸變和微核,而且低劑量VCR還具有致畸作用。為了研究VCR引起遺傳損傷的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)通過4個(gè)體外試驗(yàn)即胞質(zhì)分裂阻斷微核試驗(yàn)(染色體損傷)、hprt基因突變?cè)囼?yàn)和TCR基因突變?cè)囼?yàn)(基因突變)和彗星試驗(yàn)(DNA損傷)從不同遺傳終點(diǎn)來評(píng)價(jià)人外周血淋巴細(xì)胞暴露于不同劑量長(zhǎng)春新鹼(VCR)后所誘發(fā)的遺傳損傷。
　　2.材料與方法：
　　2.1.樣本肝素化的外周血采自男女兩名,25歲,無有毒有害

3、物質(zhì)職業(yè)接觸史健康的助血員。樣本VCR暴露最終濃度為0.00、0.01、0.02、0.04、0.08μg ml-1,暴露24h后用PBS清洗兩次。
　　2.2.方法彗星試驗(yàn):分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度并用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率,經(jīng)制片、細(xì)胞裂解、電泳、中和、染色等步驟后在熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX51)下觀察。測(cè)量彗星圖像指標(biāo)是彗星尾長(zhǎng)和尾相。胞質(zhì)分裂阻斷微核試驗(yàn):將全血于1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)44h,加入細(xì)胞松弛素B

4、,繼續(xù)培養(yǎng)28h后收獲細(xì)胞,經(jīng)離心、低滲、固定、制片、自然干燥后吉姆塞染色。高倍鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)雙核細(xì)胞,以微核率(MNR)、微核細(xì)胞率(MCR)、核芽(Buds)、核質(zhì)橋(NPBs)、和凋亡細(xì)胞(apoptotic cells)作為細(xì)胞毒性和染色體損傷指標(biāo)。另計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,計(jì)算核分裂指數(shù)(NDI)。hprt基因突變?cè)囼?yàn):基本方法與微核實(shí)驗(yàn)同。其中一份培養(yǎng)基加入0.2mM的6-巰基鳥嘌呤(Sigma)。37℃,叵溫箱中培養(yǎng)72h。

5、制片后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)同一胞漿內(nèi)具有完整核膜的相壓、相切或分離的雙核或多核的淋巴細(xì)胞數(shù),計(jì)算hprt基因突變率。TCR基因突變?cè)囼?yàn):分離淋巴細(xì)胞,用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。加入抗人CD4-fluorescein isothiocyanate(FITC)和CD3-phycoerythrin(PE)單克隆抗體(BD Biosciences),避光冰上孵育30分鐘。TCR突變CD3-CD4+T細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測(cè),

6、計(jì)算TCR基因突變率。
　　3.結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可用彗星試驗(yàn),微核試驗(yàn),hprt基因突變?cè)囼?yàn)和TCR基因突變?cè)囼?yàn)四個(gè)體外試驗(yàn)檢測(cè)出長(zhǎng)春新鹼誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞的遺傳損傷。(1)彗星試驗(yàn)助血員1:染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),助血員1的平均尾長(zhǎng)(MTL)和尾相(MTM)分別從1.87±0.09μm和0.77±0.04增至4.44±0.28μm和2.22±0.21,與對(duì)照組的1.14±0.03μm和0.51±

7、0.01相比較,差異明顯(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2:染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),助血員2的平均尾長(zhǎng)(MTL)和尾相(MTM)分別從1.76±0.07μm和0.65±0.03增至4.05±0.18μm和1.86±0.10,與對(duì)照組的1.08±0.04μm和0.49±0.02相比較,差異明顯(P＜0.05或P＜0.01)。(2)微核試驗(yàn)助血員1的結(jié)果發(fā)現(xiàn),染毒劑量從0.01μg ml-1到0.0

8、8μg ml-1時(shí),微核率、微核細(xì)胞率、核芽、核質(zhì)橋和核分裂指數(shù)(減少)分別從16.00±2.52、13.00±1.00、6.33±0.33、1.33±0.33、1.82±0.04增加(減少)到67.00±1.15、47.33±3.53、14.00±1.53、4.67±0.43、1.44±0.02,與對(duì)照組的2.00±0.58、2.00±0.58、0.00±0.0、00.00±0.00、2.34±0.01相比,有明顯差異(P＜0.05或

9、P＜0.01)。染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),凋亡細(xì)胞數(shù)從0.67±0.33增至17.33±1.20。染毒劑量0.02μg ml-1時(shí),凋亡細(xì)胞數(shù)為2.67±0.67,從該劑量開始與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2的結(jié)果發(fā)現(xiàn),染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),微核率、微核細(xì)胞率、核芽、核質(zhì)橋和核分裂指數(shù)(減少)分別從19.00±2.65、17.00±2

10、.08、5.33±0.33、1.67±0.67、1.83±0.05增加(減少)到74.67±1.33、60.00±0.58、17.00±1.53、5.00±0.58、1.44±0.02,與對(duì)照組的6.00±1.53、5.67±1.20、1.67±0.33、0.00±0.00、0.00±0.00、2.27±0.01相比,有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),凋亡細(xì)胞數(shù)從0.3

11、3±0.33增至12.67±0.88。染毒劑量0.02μgml-1時(shí),凋亡細(xì)胞數(shù)為3.33±0.33,從該劑量開始與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。(3)hprt基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果:當(dāng)染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),助血員1 Mf-hprt從0.96±0.03‰增至1.44±0.08‰,并從0.02μg ml-1劑量組(1.01±0.04)開始與對(duì)照組(0.85±0.02)相比出現(xiàn)明顯差異

12、(P＜0.05或P＜0.01)。助血員2組當(dāng)染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),Mf-hprt從0.96±0.02‰增至1.47±0.12‰,并從0.02μg ml-1劑量組(1.01±0.04)開始與對(duì)照組(0.85±0.02)相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。(4)在TCR基因突變?cè)囼?yàn)中,當(dāng)染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),助血員1 Mf-TCR從2.65±0.34×1

13、0-4增至7.68±1.13×10-4,并從0.04μg ml-1劑量組(5.78±0.67×10-4)開始與對(duì)照組(1.97±0.12×10-4)相比出現(xiàn)明顯差異(P＜0.01)。助血員2組當(dāng)染毒劑量從0.01μg ml-1到0.08μg ml-1時(shí),Mf-TCR從3.6±0.65×10-4增至6.51±0.30×10-4,并從0.02μg ml-1劑量組(4.15±0.67×10-4)開始與對(duì)照組(2.46±0.41×10-4)相比