氟致體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細胞凋亡機理的研究.pdf

1、氟過量攝入可引起機體多器官、多功能的損害，表現(xiàn)為以骨骼改變?yōu)橹鞯娜硇约膊?。在非骨相損害中，氟的免疫毒性日漸受到重視。本課題以體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細胞為研究對象，在培養(yǎng)液中加入不同濃度氟化鈉(NaF)，通過對牛脾臟淋巴細胞活性、細胞凋亡、抗氧化功能、DNA損傷、細胞內(nèi)游離Ca2+濃度、Caspase-3與Caspase-9活性及CaM、Caspase-3mRNA表達水平的檢測，旨在探討氟致牛脾臟淋巴細胞凋亡的機制。研究結果表明：

2、1.應用臺盼藍拒染試驗、四唑鹽比色法(MTT)、二硝基苯肼比色法檢測了牛脾臟淋巴細胞的活性和培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活性。結果表明，氟對牛脾臟淋巴細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為1134.32μmol/L，氟能夠抑制體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細胞的活性，并對牛脾臟淋巴細胞具有毒性作用。 2.對染氟牛脾臟淋巴細胞內(nèi)一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-

3、Px)活性的檢測。結果表明，氟能夠引發(fā)生脾臟淋巴細胞內(nèi)氧化脅迫，對免疫細胞具有毒性作用。 3.用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色熒光顯微鏡下、倒置顯微鏡下觀察不同濃度NaF誘導牛脾臟淋巴細胞凋亡的形態(tài)學變化及細胞生長情況。結果表明，氟能夠誘導牛脾臟淋巴細胞凋亡，且凋亡率具有劑量依賴性。 4.應用瓊脂糖凝膠電泳、KCl-SDS沉淀法檢測氟對牛脾臟淋巴細胞DNA的損傷作用。結果表明，氟能夠引發(fā)淋巴細胞DNA損傷，并呈

4、現(xiàn)劑量效應。 5.應用流式細胞術檢測牛脾臟淋巴細胞△ψm變化。結果表明，氟可通過引起牛脾臟淋巴細胞△ψm降低而誘導細胞凋亡。 6.應用半定量RT-PCR法和熒光探針法檢測細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平和游離Ca2+濃度。結果表明，氟能夠引起牛脾臟淋巴細胞內(nèi)CaMmRNA表達水平下降，游離Ca2+濃度升高，干擾細胞Ca2+的轉運，導致細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡而誘導細胞凋亡。 7.應用半定量RT-PCR方法檢測細胞Caspase

5、-3mRNA表達水平，比色檢測Caspase-3、Caspase-9活性。結果表明，牛脾臟淋巴細胞內(nèi)Caspase-3mRNA表達及Caspase-3、Caspase-9活性增加是氟引起牛脾臟淋巴細胞凋亡的關鍵因素。 本研究以體外培養(yǎng)染氟牛脾臟淋巴細胞為研究對象，從細胞的形態(tài)、DNA損傷、酶活性及凋亡基因表達水平等角度入手，從分子水平上揭示了氟免疫毒性機制。該研究結果可為揭示氟致動物免疫細胞損傷和免疫毒性機制提供科學的理論基礎和