錳中毒致體外培養(yǎng)雞支持-生精細胞凋亡機制的研究.pdf

1、錳是一種工業(yè)中廣泛應(yīng)用的金屬，它在體內(nèi)過量蓄積可導致毒性反應(yīng)，影響機體正常生理功能。近年來隨著生殖毒理、生殖生化等領(lǐng)域研究的發(fā)展，錳對生殖系統(tǒng)的損害已越來越受到人們的重視。目前，國內(nèi)外對錳生殖毒性的研究主要集中于哺乳動物，而對禽類幾乎沒有研究。本試驗以雞支持-生精細胞為研究對象，在培養(yǎng)體系中分別加入終濃度0、2、3、4mmol·L-1氯化錳（MnCl2），作用24 h，通過對雞支持.生精細胞活性、細胞凋亡、DNA損傷、線粒體膜電位、細胞

2、色素C蛋白表達量及細胞內(nèi)Bak、Bcl-x和Caspase-3 mRNA表達水平等方面的檢測，探討錳誘導雞支持.生精細胞凋亡的機理。研究結(jié)果表明：
　　 1應(yīng)用臺盼藍染色，WST-1比色法，二硝基苯肼比色法檢測MnCl2對雞支持.生精細胞活性的影響，結(jié)果顯示MnCl2能夠抑制雞支持-生精細胞活性，破壞支持細胞貼壁性能和生精細胞對支持細胞的依附性，表明MnCl2對雞支持.生精細胞具有毒性作用；
　　 2倒置顯微鏡下觀察雞支

3、持-生精細胞生長情況，AO/EB雙熒光染色、透射電鏡觀察不同濃度MnCl2作用下支持-生精細胞凋亡的形態(tài)學變化，結(jié)果表明MnCl2能誘導支持-生精細胞凋亡，且凋亡率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；應(yīng)用DNA Ladder、TUNEL法檢測MnCl2對雞支持-生精細胞DNA的損傷作用，結(jié)果證實MnCl2可以造成雞支持.生精細胞DNA損傷，且呈劑量一效應(yīng)關(guān)系。提示MnCl2致DNA損傷是其誘導雞支持.生精細胞凋亡的機制之一；
　　 3應(yīng)用JC-1

4、熒光探針法檢測線粒體膜電位，western bolt檢測細胞色素C蛋白表達量，試劑盒檢測Caspase-3，9和線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性，實時定量PCR法檢測Bak、Bcl-x和Caspase-3 mRNA表達水平。結(jié)果顯示MnCl2能導致支持.生精細胞線粒體膜電位降低，胞漿內(nèi)細胞色素C表達量增加，Caspase-3，9活性升高，呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ降低，Bak mRNA表達量增加，Bcl-x和Caspase-3 m