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文檔簡介
1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)可以引起豬消化道的損傷,進而導(dǎo)致嘔吐、水樣腹瀉和脫水等臨床癥狀,其病原是豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea vrius,PEDV),不同年齡階段豬群均易感,哺乳仔豬最易感,死亡率最高,該病于1971年英國最先報道,我國在1976年首次報道,2010年來,豬流行性腹瀉病再次暴發(fā),哺乳仔豬的感染率和死亡率達到了空前高度,給世界養(yǎng)殖業(yè)造
2、成了重大經(jīng)濟損失,鑒于該病的嚴重性,對該病病原的研究有重要的意義。
干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene15,ISG15)編碼的ISG15蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的類泛素修飾蛋白,被Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)表達,屬于類泛素修飾蛋白家族,ISG15的高水平表達可以影響病毒的復(fù)制,而PEDV的先天免疫與ISG15的關(guān)系尚不明確。本研究以干擾素缺陷型猴腎細胞系(Vero)為模型,對ISG15在PEDV復(fù)制過程中的作用
3、進行了初步的探討。
基于以上背景,本研究對河南省流行性腹瀉病毒流行株變異情況進行監(jiān)測和探究,同時構(gòu)建穩(wěn)定表達ISG15蛋白的細胞系,在此基礎(chǔ)上探究了PEDV與ISG15蛋白的相互作用,為進一步研究ISG15抗病毒機制和PEDV逃逸細胞先天免疫機制奠定了基礎(chǔ)。研究的主要內(nèi)容分為以下三個部分:
1.河南省2014-2015年豬流行性腹瀉病毒流行株遺傳進化分析
對15株2014-2015年間河南省PEDV流行株S
4、基因進行克隆及序列測定,與河南省2011-2013年間流行株以及國內(nèi)、外代表毒株進行同源性及遺傳變異分析,并對這些毒株S基因的N-糖基化位點及跨膜螺旋區(qū)域進行預(yù)測。結(jié)果表明:本試驗得到的15株毒株之間S基因核苷酸同源性為97.0-99.8%,氨基酸同源性為97.0-99.5%;與2011-2013年河南流行株核苷酸同源性為97.1-99.0%,氨基酸同源性為97.2-98.8%,與其他地區(qū)流行毒株核苷酸同源性為92.2%-99.0%,氨
5、基酸同源性為91.9%-99.0%;與經(jīng)典毒株相比,S1區(qū)域N端存在15bp的插入和6bp的缺失,核苷酸同源性為91.7%-93.6%,氨基酸同源性為92.0%-93.6%。系統(tǒng)發(fā)育建樹結(jié)果顯示目前的流行毒株與經(jīng)典毒株處于不同的兩個群,流行毒株分處不同亞群。對N-糖基化位點及跨膜螺旋區(qū)域的預(yù)測得知2014-2015年河南省PEDV與經(jīng)典株相比出現(xiàn)變異,與2010年暴發(fā)時相比存在部分突變,毒株之間存在部分差異。
2.穩(wěn)定過表達豬
6、ISG15基因Vero細胞系的建立
構(gòu)建穩(wěn)定表達豬ISG15基因的Vero細胞系,利用真核轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(PiggyBac,PB)將豬源ISG15基因轉(zhuǎn)染入Vero細胞中,通過嘌呤霉素抗性和綠色熒光進行雙重篩選獲得陽性轉(zhuǎn)染細胞,再經(jīng)過克隆純化得到單個陽性細胞株,將細胞進行傳代后檢測,借助實時定量熒光基因擴增(Real-time Quantitative PCR,qPCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(western-bloting,WB)方法
7、鑒定該基因的表達,結(jié)果表明,篩選得到的piggybc-ISG15-Vero細胞株可穩(wěn)定表達ISG15,表明穩(wěn)定表達豬ISG15基因的Vero細胞系構(gòu)建成功,為進一步研究豬ISG15基因的功能以及作用機制奠定了基礎(chǔ)。
3.ISG15和PEDV相互作用的初步研究
探究ISG15蛋白和PEDV相互作用關(guān)系,為后續(xù)研究PEDV逃逸細胞先天免疫機制奠定基礎(chǔ),將PEDV疫苗株CV777分別接種于piggybc-ISG15-Ver
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