豬ISG15抗PRV作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、干擾素刺激基因15（Interferon stimulated gene15，ISG15）編碼的ISG15蛋白作為抗病毒天然免疫反應(yīng)中重要的一員，參與腫瘤免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過程。作為ISG家族中第一個(gè)被鑒定的類泛素蛋白，與泛素相似，ISG15可通過酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白共價(jià)結(jié)合。目前已證實(shí)ISG15的靶蛋白已超過上百種。研究表明，人源和鼠源ISG15具有抗病毒作用和調(diào)控干擾素信號(hào)通路的作用，但豬源ISG1

2、5的作用尚不清楚。本研究旨在克隆表達(dá)豬ISG15，制備多克隆血清，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬ISG15基因的PK-15細(xì)胞系，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探究豬ISG15抑制偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)復(fù)制的作用，以期探究豬ISG15的功能，并為PR的防控提供新的思路。
　　1.豬ISG15蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　從家豬外周血液淋巴細(xì)胞中抽提總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用GcncBank中公布的野

3、豬ISG15的基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出豬ISG15基因，測(cè)序后，通過生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行分析。ISG15基因片段與pET28a載體連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-pISG15，轉(zhuǎn)化至BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過N1柱純化，獲得ISG15蛋白。用重組的ISG15蛋白免疫家兔，制備多克隆血清。結(jié)果表明，豬ISG15基因CDS區(qū)長(zhǎng)504bp，編碼167個(gè)氨基酸，包括兩個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域:N端的第3～75位氨基酸肽段，C端的第81

4、～156位氨基酸肽段，及其C末端核心序列LRLRGG。Western blot分析結(jié)果表明，重組ISG15蛋白的免疫原性良好，ELISA方法測(cè)定結(jié)果顯示，血清抗體效價(jià)為1∶102400。此試驗(yàn)為豬ISG15功能的進(jìn)一步探究奠定基礎(chǔ)。
　　2.穩(wěn)定過表達(dá)豬ISG15基因PK-15細(xì)胞系的構(gòu)建
　　將豬ISG15基因克隆于PiggyBac真核轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中，成功構(gòu)建PiggyBac-pISG15重組真核表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)染的方法將

5、豬ISG15基因轉(zhuǎn)入PK-15細(xì)胞，使用濃度為5ug/mL的嘌呤霉素初步篩選兩周后，然后通過有限稀釋法克隆出穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。通過熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)豬ISG15基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系綠色熒光蛋白的表達(dá)穩(wěn)定，豬ISG15基因表達(dá)量增加9倍左右，連續(xù)傳代15代，ISG15的表達(dá)量依然穩(wěn)定，說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)豬ISG15基因的PK-15細(xì)胞株構(gòu)

6、建成功，命名為PI-15。此試驗(yàn)為進(jìn)一步探究豬ISG15的功能提供了有效工具。
　　3.豬ISG15對(duì)PRV復(fù)制的影響
　　為研究豬ISG15對(duì)PRV的影響，本試驗(yàn)將PRV＿QXX株接種于穩(wěn)定表達(dá)豬ISG15的PK-15細(xì)胞系（PI-15），分別在接毒后12h、24h、36h和48h收毒，通過熒光定量PCR和蝕斑試驗(yàn)方法檢測(cè)PRV的基因相對(duì)表達(dá)量和病毒滴度。針對(duì)豬ISG15保守序列設(shè)計(jì)siRNA，利用RNAi技術(shù)敲減過表達(dá)細(xì)

7、胞系中ISG15的表達(dá)，在PRV感染情況下，通過熒光定量PCR和蝕斑試驗(yàn)方法檢測(cè)PRV基因的相對(duì)表達(dá)量和病毒滴度，反向驗(yàn)證豬1SG15對(duì)PRV的影響。結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照組細(xì)胞相比，在接毒24h時(shí)，豬ISG15過表達(dá)細(xì)胞抑制病毒的基因表達(dá)量達(dá)5倍以上，病毒滴度下降了約5倍;ISG15的表達(dá)被敲減后，其對(duì)PRV復(fù)制的抑制作用幾乎消失，反向驗(yàn)證了豬ISG15具有抑制PRV復(fù)制的作用。本試驗(yàn)為豬PRV的防治提供新的思路。
　　4.豬I

8、SG15對(duì)干擾素及相關(guān)因子的影響
　　為探究豬ISG15對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響，本試驗(yàn)構(gòu)建了重組載體pCAGGS-HA-pISG15，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)豬ISG15對(duì)豬IFN-β啟動(dòng)子活性的影響，并利用過表達(dá)ISG15細(xì)胞系，通過熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)ISG15對(duì)豬IFN-β及其他幾種細(xì)胞因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，豬ISG15可以激活豬IFN-β啟動(dòng)子，細(xì)胞感染PRV前后，過表達(dá)ISG15均可上調(diào)IFN-β、OAS