土撥鼠天然免疫分子RELA、ISG15的克隆及W12-6細(xì)胞中TLR信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、目的：
　　土撥鼠模型被廣泛用于慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理(包括免疫發(fā)病機(jī)制)研究、抗病毒藥物及治療策略的評(píng)估。目前乙型肝炎病毒(HBV)感染的天然免疫應(yīng)答及TLR配體用于慢性乙肝治療是HBV研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。但土撥鼠天然免疫分子RelA和ISG15的序列尚未見報(bào)道。本研究對(duì)土撥鼠天然免疫分子RelA、ISG15以及內(nèi)參分子GAPDH進(jìn)行了克隆和序列分析,同時(shí)研究了土撥鼠成纖維細(xì)胞系W12/6細(xì)胞在TLR1/TLR2、TLR3、TL

2、R4配體刺激下TLR信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1.通過對(duì)比Genebank中人、豬、牛、小鼠、大鼠的RelA、ISG15和GAPDH序列,設(shè)計(jì)保守引物,提取土撥鼠W12/6細(xì)胞的總RNA作為模板,RT-PCR擴(kuò)增獲得土撥鼠RelA、ISG15和GAPDH的cDNA序列。PCR產(chǎn)物純化后連接至T載體(pMD18-T),構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-mhRelA、pMD18-T-mhISG15和pMD18-T-

3、mhGAPDH。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR初篩及酶切鑒定,選擇陽性克隆測(cè)序。對(duì)所獲得的序列進(jìn)行同源性和種系進(jìn)化分析。
　　2.分別用TLR1/TLR2、TLR3、TLR4配體刺激W12/6細(xì)胞,在三小時(shí)、六小時(shí)、十二小時(shí)后分別提取細(xì)胞總RNA,Realtime-PCR分析TLRs信號(hào)通路中IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IFNβ、IL1β、IL6、ISG15和RelA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.獲得土撥鼠Rel

4、A部分序列為1559bp,其中編碼序列為1481bp,編碼493個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列與人RelA同源性最高,達(dá)89％,氨基酸序列則與人,豬,大鼠小鼠RelA同源性均較高,達(dá)85%。種系發(fā)生分析提示土撥鼠RelA與大鼠RelA的親緣關(guān)系最近。
　　2.獲得土撥鼠ISG15部分序列為370bp,均為編碼序列,編碼123個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列與獼猴同源性最高,為78%,氨基酸序列則與人和獼猴ISG15同源性最高

5、,為69%。種系發(fā)生分析提示土撥鼠ISG15與人ISG15的親緣關(guān)系最近。
　　3.獲得土撥鼠GADPH序列為1214bp,其中編碼序列為1002bp,編碼334個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn)該核苷序列和氨基酸序列均與貓GAPDH的同源性最高,分別達(dá)93%和98%。種系發(fā)生分析亦提示土撥鼠GAPDH與穴兔GAPDH親緣關(guān)系最近。
　　4.在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IFNβ、IL1β、IL6、ISG15

6、和RelA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):
　　(1)用TLR1/2配體刺激W12/6細(xì)胞3小時(shí)后,僅IL1β表達(dá)較對(duì)照組略有升高(無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);刺激6小時(shí)后,除IL1β和IL6外,其余分子表達(dá)均較對(duì)照組有所升高;刺激12小時(shí)后,未檢測(cè)到表達(dá)高于對(duì)照組的分子。
　　(2)用TLR3配體刺激W12/6細(xì)胞3小時(shí)后,除IRF3、IRF5、IL1β、ISG15外,其余分子表達(dá)均較對(duì)照組有所升高;刺激6小時(shí)后,未檢測(cè)到表達(dá)高于對(duì)照組的分子;刺激1

7、2小時(shí)后,僅IRF5表達(dá)高于對(duì)照組。
　　(3)用TLR4配體刺激W12/6細(xì)胞3小時(shí)后,除IRF3和IRF5外,其余分子表達(dá)均較對(duì)照組有所升高;刺激6小時(shí)后,僅IRF1和IL6表達(dá)高于對(duì)照組;刺激12小時(shí)后,IRF1、IRF5、IRF7、IL1β、IL6、ISG15和RelA表達(dá)均高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.獲得土撥鼠RelA、ISG15分子cDNA序列,為土撥鼠模型用于天然免疫相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　2

8、.發(fā)現(xiàn)土撥鼠RelA、ISG15在核苷酸和氨基酸水平均與人的RelA和ISG15同源性較高,與我們之前對(duì)土撥鼠IFNAR、IL6、IL15等分子的研究結(jié)果類似。
　　3.TLR1/2、TLR3、TLR4的配體刺激能誘導(dǎo)W12/6細(xì)胞TLR信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)上調(diào),且W12/6細(xì)胞對(duì)不同配體刺激的應(yīng)答存在一定的時(shí)效性。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.獲得土撥鼠ISG15和RelA的部分序列以及GAPDH的全長序列。
　　2.