HBsAg干擾巨噬樣細(xì)胞TLR信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)是一種有不完全環(huán)狀雙鏈DNA的胞膜病毒,感染人體后引起不同的臨床表現(xiàn),有一過(guò)性的急性肝炎、持續(xù)性慢性肝炎,甚至致死性的暴發(fā)性肝炎。現(xiàn)在一般認(rèn)為免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的宿主與病毒的相互作用決定著HBV感染后病毒的清除和肝炎病變的進(jìn)程。多個(gè)研究顯示,機(jī)體對(duì)HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的活力、多樣性及效應(yīng)功能是HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵,因此,機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)功能障礙被認(rèn)為是HBV持續(xù)性感染的重要原因。目前造成HBV持續(xù)性感染患者T細(xì)胞反

2、應(yīng)障礙的原因還不清楚,但啟動(dòng)特異性T細(xì)胞反應(yīng)的抗原呈遞功能受阻一定在其中發(fā)揮作用。Toll樣受體(TLRs)家族屬于構(gòu)型識(shí)別受體(PRRs)成員,介導(dǎo)識(shí)別病原體保守的分子結(jié)構(gòu),在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn),TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)的抗原呈遞細(xì)胞活化是啟動(dòng)正常T細(xì)胞免疫反應(yīng)的前提,而一些病毒的蛋白通過(guò)與TLRs及其下游的信號(hào)分子相互作用干擾TLR信號(hào)通路的活化,這提示病毒可以通過(guò)影響TLR信號(hào)通路的活化來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的抗原呈

3、遞。HBV的病毒蛋白是否也能利用這種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制則有待證明。
　　 為此本研究選用THP-1分化的巨噬樣細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察HBV感染后分泌產(chǎn)生最多的胞膜蛋白-乙肝表面抗原(HBsAg)對(duì)TLR信號(hào)通路活化的影響。首先通過(guò)Real—time PCR的方法檢測(cè)了THP—1和THP—1在PMA刺激下誘導(dǎo)分化的巨噬樣細(xì)胞的TLR表達(dá)譜。結(jié)果顯示,THP-1分化為巨噬樣細(xì)胞后,多數(shù)TLRs的表達(dá)有明顯的增加。且在巨噬樣細(xì)胞中,TLR1

4、、TLR2、TLR4和TLR6的表達(dá)明顯高于其他TLRs。為在TLR信號(hào)通路充分活化的情況下研究HBsAg的調(diào)節(jié)效應(yīng),選擇激活巨噬樣細(xì)胞上高表達(dá)的TLRs信號(hào)通路作進(jìn)一步研究。TLR1/2的配體pam3csk4和TLR4的配體LPS刺激細(xì)胞后,通過(guò)Real-time PCR和ELISA分別從蛋白水平和mRNA水平的檢測(cè)IL—10和IL—12表達(dá),結(jié)果顯示HBsAg的胞外處理能以劑量依賴的方式干擾pam3csk4和LPS誘導(dǎo)的IL—10和

5、IL—12的產(chǎn)生,提示HBsAg能干擾巨噬樣細(xì)胞TLR信號(hào)通路活化。為了解HBsAg對(duì)TLR下游信號(hào)通路的影響,利用免疫熒光分析了LPS和pam3csk4誘導(dǎo)的NF-κB p65入核情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HBsAg的存在明顯干擾pam3csk4和LPS誘導(dǎo)的NF—κB p65入核,Western blotting檢測(cè)結(jié)果同樣顯示,HBsAg能抑制誘導(dǎo)的pam3csk4和LPS誘導(dǎo)的IκB—α降解,這提示HBsAg對(duì)TLRs下游的NF—κ B通

6、路有干擾效應(yīng)。進(jìn)一步用Western blotting檢測(cè)磷酸化ERK蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示HBsAg阻止了pam3csk4和LPS誘導(dǎo)的ERK蛋白磷酸化,說(shuō)明HBsAg對(duì)TLRs下游的ERK通路也有影響。上述結(jié)果再次證明HBsag對(duì)TLR信號(hào)通路活化的抑制作用。為進(jìn)一步了解HBsAg干擾TLR信號(hào)通路的機(jī)制,Real—time PCR檢測(cè)了HBsAg的處理對(duì)巨噬樣細(xì)胞TLRs表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,HBsAg并不依賴下調(diào)TLRs的表達(dá)來(lái)干

7、擾TLR信號(hào)通路活化,甚至HBsAg能上調(diào)TLR4的表達(dá)。除了干擾TLRs的膜外識(shí)別,細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)因子也能影響TLR信號(hào)通路的活化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)節(jié)因子可影響TLR信號(hào)的傳導(dǎo),包括MyD88s、IRAK3、Tollip、IRF家族的IRF4與IRF5及SOCS家族的SOCS1和SOCS3等。通過(guò)Real—time PCR分析HBsAg胞外處理對(duì)這些調(diào)節(jié)因子的表達(dá)影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg能上調(diào)SOCS1的表達(dá),提示HBsAg可能通過(guò)上調(diào)S