酸性肽、大豆黃酮和C肽對神經(jīng)元內(nèi)APP、NOS1及β-分泌酶表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能喪失為臨床特征的大腦退行性疾病,其神經(jīng)病理學(xué)特征為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)、神經(jīng)細(xì)胞外則表現(xiàn)為老年斑(senile plaques,SPs)。有研究表明β-淀粉樣蛋白(Aβ)對膽堿能神經(jīng)元的毒性是Alzheimer病的主要機(jī)制。因此對Aβ的產(chǎn)生、降解和清除的分子生物學(xué)研究是目前研究A

2、lzheimer病的熱點之一。近年來,一氧化氮(NO)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的病理生理作用成為神經(jīng)科學(xué)研究的又一個熱點。NO是一種血管神經(jīng)活性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)腦血流、促進(jìn)或抑制遞質(zhì)釋放、參與突觸可塑性、神經(jīng)元興奮毒性及炎癥性損害等多種作用,且與學(xué)習(xí)記憶有關(guān),但過量的NO可通過過氧化應(yīng)激、干擾腦內(nèi)能量代謝使細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)紊亂等多種途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大量實驗資料和臨床觀察表明,大腦海馬區(qū)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。如果損傷海馬、穹窿、下丘腦乳頭體或乳頭體丘腦束

3、及其鄰近結(jié)構(gòu),可引起近期記憶功能的喪失。海馬細(xì)胞原代培養(yǎng)是研究神經(jīng)細(xì)胞的重要手段之一。
　　本實驗原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,利用一氧化氮參與缺血缺氧損傷的病理生理過程的特點來誘導(dǎo)神經(jīng)元為癡呆模型細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞之間信息傳遞方式需要通過神經(jīng)遞質(zhì)來實現(xiàn)。酸性肽是本實驗室分離出的一個小分子神經(jīng)肽,它廣泛存在于動物的大腦中,參與多種功能的調(diào)節(jié)。它對老年性癡呆具有治療作用。大豆黃酮(soybean flavone),是一種類黃酮化合物。有研究證實大

4、豆黃酮可以提高抗氧化酶的活性,因而能提高機(jī)體的抗氧化能力。
　　本實驗通過大豆黃酮對癡呆模型的海馬神經(jīng)元內(nèi)一些蛋白質(zhì)分子水平的作用研究,探討了其延緩腦老化的生物學(xué)機(jī)制。C肽是本實驗從動物體中分離的另一肽類化合物。本實驗初步研究了C肽和神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系。
　　材料與方法:用新生24小時內(nèi)的SD大鼠經(jīng)解剖分離海馬,胰蛋白酶消化,獲得單細(xì)胞懸液,通過接種、換液等步驟,培養(yǎng)10-12天,生物性狀穩(wěn)定可用于實驗。以下是實驗的主要步

5、驟。1、解剖分離出海馬組織。2、培養(yǎng)到第10到11天的神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,神經(jīng)元純化率達(dá)95％以上時進(jìn)行下列實驗。3、體外培養(yǎng)至10天的神經(jīng)元用酸性肽、大豆黃酮、C肽分別以三種不同濃度預(yù)處理6小時,然后再加入終濃度為50umol/L的硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)處理海馬神經(jīng)元。實驗分為11組。Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:SNP處理組;Ⅲ組:0.15mg/mL酸性肽+SN

6、P組;Ⅳ組:0.3mg/mL酸性肽+SNP組;Ⅴ組:0.6mg/mL酸性肽+SNP組;Ⅵ組:0.15mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅶ組:0.3mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅷ組:0.6mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅸ組:0.15mg/mLC肽+SNP組;Ⅹ組:0.3mg/mLC肽L+SNP組;Ⅺ組:0.6mg/mLC肽+SNP組。以上11組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至24小時進(jìn)行以下實驗,做細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。通過德國Lecia顯微照相系統(tǒng)采集免

7、疫細(xì)胞化學(xué)染色后的圖片,然后經(jīng)Biosens Digital ImagingSystem v1.6測定陽性區(qū)的灰度值,其中每張片至少選取5個視野,取均值。數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,顯著性檢驗采用單因素方差分析及秩和檢驗分析,以α=0.05作為有顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.成功建立了新生(24h)SD大鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型,并建立了SNP誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡的模型。2.酸性肽、大豆黃酮、C肽能拮抗SNP的神經(jīng)毒

8、性。細(xì)胞的免疫化學(xué)染色顯示酸性肽、大豆黃酮、C肽在實驗范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系。與對照組相比,SNP處理的海馬神經(jīng)元的淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)、β-分泌酶(β-secretase,BACE)、NO化氮合酶1(NO synzyme1,NOS1)的表達(dá)顯著增加(P<0.05);與SNP組相比,各濃度AP組、高濃度大豆黃酮組、各濃度C肽組的海馬神經(jīng)元內(nèi)APP、BACE、NOS1的表達(dá)明顯降低(P<