G蛋白偶聯(lián)受體激酶5缺陷在早期阿爾茨海默病發(fā)病機制中的潛在作用.pdf

1、第一部分： 背景：現(xiàn)已知道性別在阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病中是一不容忽視的危險因素，許多研究表明，AD的患病率女性顯著高于男性；與男性相比，女性AD患者腦內呈現(xiàn)出更為嚴重的病理變化。最近研究揭示G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）激酶5（GRK5）缺陷引起的相關GPCRs 脫敏障礙在早期AD的病理發(fā)生機制中具有重要作用，而且GRK5敲除/缺陷（GRK5KO）小鼠表現(xiàn)出早期AD病理特征和短時期記憶功能損害。但是這種病理變化在不同性別間有沒

2、有差異，目前不得而知。目的：研究GRK5KO小鼠出現(xiàn)的AD樣病理變化是否存在性別差異，并探討其分子機制。 方法：用Campbell-Switzer銀染和免疫熒光染色來觀察老化的GRK5KO小鼠海馬內腫脹軸突的病理變化；Western blotting檢測海馬內突觸蛋白水平的變化；同時對上述改變在不同性別間進行深入比較。此外，用免疫酶聯(lián)吸附試驗檢測黃體生成素（LH）誘導的環(huán)磷酸腺苷的聚積量。 結果：雌性GRK5KO小鼠海馬

3、內呈簇狀分布的腫脹軸突數(shù)目比雄性小鼠高出2.5 倍；而且雌性GRK5KO小鼠海馬內數(shù)個突觸蛋白水平（包括突觸素）比雄性小鼠顯著減低。雙因素方差分析顯示性別和GRK5 缺陷雙因素之間呈顯著協(xié)同效應，共同促進了雌性GRK5KO小鼠軸突缺陷和部分突觸蛋白水平的降低。另外，LH活性增加據(jù)認為是引起AD性別差異現(xiàn)象的重要原因，但在本實驗中LH受體脫敏并不受GRK5缺陷的影響。由此可見，雌性GRK5KO小鼠出現(xiàn)惡化的病理改變并不是由于LH受體脫敏損

4、害造成的。 結論：在促進雌性GRK5KO小鼠出現(xiàn)早期AD樣病理改變的過程中，GRK5缺陷和性別雙因素表現(xiàn)出協(xié)同效應，盡管目前其潛在的分子機制尚未闡明。 第二部分： 背景：最近的研究顯示功能性（膜上）G蛋白偶聯(lián)受體激酶5（GRK5）缺陷與早期阿爾茨海默?。ˋD）的病理發(fā)生機制存在聯(lián)系。體外試驗表明，GRK5 缺陷通過損害相關G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）脫敏可以促進小膠質細胞的激活。但令人遺憾的是，GRK5敲除/缺陷

5、小鼠（GRK5KO）除了有中等程度的軸突缺陷和突觸退變以及輕度水平的β淀粉樣肽（Aβ）水平上升外，并沒有發(fā)現(xiàn)纖絲狀Aβ沉積，也沒有表現(xiàn)出任何小膠質細胞增生跡象。一種可能的解釋是體內GRK5缺陷導致的功能缺失有可能被其他的GRK成員所代償；另外一種原因在于缺少炎癥啟動因子，諸如纖絲狀Aβ。 目的：研究在纖絲狀Aβ存在時，GRK5缺陷是否會加劇轉瑞典突變淀粉樣肽前體蛋白基因（TgAPPsw，Tg2576）小鼠腦內的炎癥反應，并探討其

6、作用機制。 方法：將具有C57/BL6遺傳背景的GRK5KO雜合子與具有相同遺傳背景的Tg2576 小鼠雜交，以產生野生型（WT）、GRK5KO雜合子型、轉淀粉樣肽前體蛋白（APP）基因型以及轉基因&敲除（Double）型4種基因型小鼠。用定性和定量免疫熒光（IF）染色方法來評價這些動物腦內小膠質和星形膠質細胞的增生反應。用IF染色和Western blotting分別檢測腦內Aβ沉積量和水平的變化。 結果：抗CD45、

7、CD11b、OX42和白介素1β特異性抗體的IF染色可以特征化小膠質細胞的變化。IF染色結果定量分析顯示，Tg2576小鼠被滅活一個拷貝的GRK5基因后導致海馬和皮層內小膠質細胞數(shù)量和Aβ沉積量（包括負荷量與數(shù)量）同時上升了近1倍左右，并伴有星形膠質細胞的顯著增生。而且激活的小膠質和星形膠質細胞大多位于或環(huán)繞于纖絲狀Aβ斑塊附近。但IF染色未發(fā)現(xiàn)WT和GRK5KO小鼠腦內有明顯膠質細胞增生改變，也沒有纖絲狀Aβ沉積。此外，Aβ的West

8、ern blotting檢測結果與IF染色相互印證。Spearman等級相關檢驗發(fā)現(xiàn)APP和Double小鼠海馬和皮層內Aβ沉積量（負荷量/數(shù)量）與對應的小膠質細胞/星形膠質細胞數(shù)量均呈高度顯著正相關。 結論：Tg2576 小鼠GRK5基因敲除50％后，確實加劇了腦內的炎癥反應，但其加劇的方式不是直接對炎癥調節(jié)因子加以調控，而主要是通過增強對炎癥啟動因子（纖絲狀Aβ）的調節(jié)來發(fā)揮作用的。 第三部分： 目的：研究體

9、內G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）激酶5（GRK5）缺陷加劇轉瑞典突變淀粉樣肽前體蛋白（TgAPPsw，Tg2576）基因小鼠腦內纖絲狀β淀粉樣肽（Aβ）沉積的分子機制。 方法：將具有C57/BL6遺傳背景的GRK5敲除/缺陷小鼠（GRK5KO）雜合子與具有相同遺傳背景的Tg2576 小鼠雜交以建立APP（hAPPsw+/-/GRK5+/+）型及轉基因&敲除（Double，hAPPsw+/-/GRK5）型小鼠+/- 。用Wester

10、n blotting檢測APP和Double型6月齡雌性小鼠腦內以及17天齡胎鼠皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上全長APP（flAPP）和可溶性APPα（sAPPα）的變化。 結果：APP與Double型的6月齡小鼠腦內flAPP水平無差異，但Double小鼠sAPPα水平較APP小鼠明顯減低；胎鼠皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上flAPP水平及sAPPα基礎釋放量的變化與6月齡小鼠類似，但經(jīng)用乙酰膽堿毒蕈堿樣受體（M）2 特異性拮抗劑處理后，