靶向siRNA阻斷NF-κB信號通路對膽管癌增殖和侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膽管癌起源于膽管上皮細(xì)胞惡性腫瘤，是肝膽外科常見的惡性腫瘤之一。由于其早期診斷困難及其自身臨床病理特征，癌細(xì)胞容易沿血管及神經(jīng)鞘浸潤擴(kuò)散。雖然手術(shù)是唯一可能獲得治愈的手段，但大部分根治手術(shù)切除率低術(shù)后易復(fù)發(fā)，且放化療無助于生存率的提高，目前缺乏對膽管癌有效治療手段?；诎┑陌l(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)過程，干預(yù)或終止其中某個(gè)或多個(gè)相關(guān)因素或過程，能夠改變癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，達(dá)到化學(xué)預(yù)防和治療的目的。針對腫瘤相關(guān)因子，明確基因功能，選

2、擇靶點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)干預(yù)，是惡性腫瘤的預(yù)防和治療策略。實(shí)施這些策略的首要前提是必須確定和選擇作用靶點(diǎn)，即研究腫瘤相關(guān)基因的功能和表達(dá)。流行病學(xué)調(diào)查膽管癌發(fā)病的高危因素共同病理特征是膽道的慢性炎癥。 NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和增殖的多種基因的表達(dá)調(diào)控，而且NF-κB的異常激活還在多種腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲調(diào)控中發(fā)揮中樞性作用，是“炎癌鏈”的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)。有證據(jù)表明針對抑制炎癥介質(zhì)釋放的

3、非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)能顯著減少許多炎癥相關(guān)性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，日益凸顯作為化學(xué)預(yù)防和輔助治療藥物的效用。在部分實(shí)體腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究揭示針對NF-κB信號通路中下游基因COX-2表達(dá)可作為腫瘤預(yù)后重要指標(biāo)，環(huán)氧化合酶-2選擇性抑制劑非甾體類抗炎藥物能減少腸癌發(fā)生率。NF-κB信號通路是近年來研究腫瘤潛在性靶點(diǎn)重大發(fā)現(xiàn)之一，NF-κB在多數(shù)腫瘤細(xì)胞存在過表達(dá)，可能上調(diào)啟動子中含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的COX-2、iNOS下游基因

4、，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。非淄類抗炎藥物在拮抗炎癥及抗腫瘤反應(yīng)方面，雖療效確切，但因其作用廣泛，故對機(jī)體有一定的毒、副作用，且由于眾多的炎癥介質(zhì)(包括尚未發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì))構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)及炎癥介質(zhì)介導(dǎo)使得針對單一(或少量)炎癥介質(zhì)的逐一對抗腫瘤措施顯得力不從心，而多種抗體/拮抗劑/抑制劑的聯(lián)合搭配使用雖有可能提高療效，但在臨床實(shí)施過程中顯然不太可行。只有從調(diào)控“炎癌鏈反應(yīng)”的“瓶頸”-即關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，才有可能從根本上解決逆轉(zhuǎn)炎癥

5、狀態(tài)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增生的微環(huán)境達(dá)到根本上預(yù)防治療腫瘤，NF-κB被認(rèn)為極具潛力的新型抗腫瘤靶點(diǎn)，從理論上講，如能有效拮抗NF-κB活化，則可起到以一當(dāng)十、事半功倍的抗腫瘤效果。本課題正是基于膽管癌主要慢性炎癥的病理特點(diǎn)，著眼NF-κB信號通路“炎癌鏈”關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察膽管癌NF-κB信號表達(dá)情況，并利用NF-κBp65靶向性小干擾技術(shù)阻斷NF-κB信號通路，探討體內(nèi)外抗增殖及侵潤作用，以期為獲取具有自

6、主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤藥物先導(dǎo)物的形成提供契機(jī)，并為具有兼顧拮抗失控性炎癥反應(yīng)和抗腫瘤的新型靶向性抗腫瘤藥物的臨床過渡奠定基礎(chǔ)。 目的： 探討NF-κB的表達(dá)在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，及其與COX-2和iNOS的關(guān)系，并設(shè)計(jì)應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)沉默膽管癌細(xì)胞的NF-κB，研究其阻斷NF-κB信號通路后體內(nèi)外抑制細(xì)胞增殖侵襲影響效果及作用機(jī)制。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法、WesternBlotting分別檢測中膽管癌組織

7、NF-κB、COX-2及iNOS基因蛋白分布表達(dá)情況。分析NF-κB表達(dá)與COX-2及iNOS表達(dá)的相關(guān)性以及在膽管癌中表達(dá)的臨床應(yīng)用價(jià)值：進(jìn)一步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)手段，以NF-κBp65為靶點(diǎn)，篩選優(yōu)化siRNA，探討靶向NF-κBp65-siRNA對膽管癌細(xì)胞中NF-κBp65基因蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖影響，從而為NF-κB信號通路NF-κB作為抗瘤潛在靶點(diǎn)的功能研究開辟了一個(gè)新的途徑，并對靶向NF-κB抑制膽管癌細(xì)胞的體內(nèi)效果做了進(jìn)一

8、步的驗(yàn)證，為探求靶向的基因治療在膽管癌基因治療中的可行性、效應(yīng)及初步的作用機(jī)制。為臨床炎癥相關(guān)性腫瘤的治療探索新方法。 方法： 收集臨床病理資料完整的膽管癌組織石蠟標(biāo)本69份及其癌旁組織石蠟標(biāo)本19份，新鮮肝外膽管癌組織及癌旁組織9份，另有同期良性膽道石蠟標(biāo)本56份做為對照組，其中包括：慢性膽囊炎27例，硬化性膽管炎，膽管囊性擴(kuò)張13例。分別應(yīng)用免疫組化法、免疫印跡技術(shù)檢測以上標(biāo)本中NF-κB與iNOS、COX-2的表達(dá)

9、，分析NF-κB的表達(dá)與COX-2及iNOS表達(dá)的相關(guān)性及它們與膽管癌發(fā)生的臨床相關(guān)性。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用QBC939膽管癌細(xì)胞系，干擾過表達(dá)NF-κB p65，以MTT法、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦分析NF-κBp65對膽管癌細(xì)胞體外增殖活性、侵襲性的影響，并觀察其定位；進(jìn)一步應(yīng)用western blotting、RT-PCR研究靶向NF-κBp65的siRNA對下游基因的影響作用及細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。最后，通過建立膽管癌裸鼠移植瘤模型，

10、應(yīng)用靶向NF-κBp65的siRNA進(jìn)行瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射，觀察靶向NF-κBp65的siRNA對人膽管癌裸鼠移植瘤抗腫瘤效果。 結(jié)果： 69膽管癌組織病理切片免疫組化檢測結(jié)果顯示：膽管癌組織中NF-κB與iNOS、COX-2的陽性表達(dá)率分別是74.07％、66.67％和62.9％，NF-κB與iNOS、COX-2在膽管癌組織中的表達(dá)水平明顯高正常組織中的表達(dá)水平(P＜0.05)，NF-κB與iNOS、COX-2的表達(dá)與膽管

11、癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)(P＜0.05)；免疫印跡技術(shù)NF-κB與iNOS、COX-2蛋白表達(dá)水平在癌組織中明顯高于對應(yīng)的癌旁組織(P＜0.05)。NF-κB與iNOS、COX-2的表達(dá)呈正相關(guān)，聯(lián)合檢測提示可作為膽管癌總體生存的負(fù)預(yù)后因素。Western blotting和RT-PCR檢測結(jié)果顯示體外設(shè)計(jì)合成的NF-κB p65靶向siRNA優(yōu)化后的濃度1.2μg/ml轉(zhuǎn)染QBC939細(xì)胞后48h NF-κB p65mR

12、NA和蛋白質(zhì)的表達(dá)能分別抑制51.3％，47.8％，并有時(shí)間和濃度依存性；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)染靶向NF-κBp65-siRNA后，細(xì)胞的增殖活性被抑制；晚期凋亡率增加，進(jìn)一步應(yīng)用western blotting檢測抑凋亡蛋白iNOS、COX-2均表達(dá)顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向NF-κB p65-siRNA后，iNOS、COX-2表達(dá)均下調(diào)；共聚焦結(jié)果顯示，NF-κB在胞核有分布。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)亦表明，靶向NF-κB p65-siRNA能夠顯著

13、抑制裸鼠移植瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。免疫組化及RT-PCR，western blot分別檢測體內(nèi)NF-κB p65、iNOS、COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)受明顯抑制率分別為42.3％，35.6％，36，1％；54.3％，55.6％，41.1％與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。 結(jié)論： NF-κB、iNOS及COX-2的表達(dá)與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，隨著病情惡化，NF-κB、iNOS及COX-2的陽性率逐漸增加，

14、兩者呈正相關(guān)。應(yīng)用免疫組化聯(lián)合檢測膽管癌組織中的NF-κB、iNOS及COX-2表達(dá)可能會有助于膽管癌的預(yù)后判斷。在膽管癌QBC939細(xì)胞中，靶向NF-κBp65的siRNA能夠有效抑制細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，同時(shí)導(dǎo)致iNOS、COX-2表達(dá)的下調(diào)。在膽管癌裸鼠移植瘤模型中，靶向NF-κBp65的siRNA能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)表明：NF-κB可能為靶向基因治療的潛在關(guān)鍵分子靶標(biāo)；而靶向NF