TGF-β3促進(jìn)軟骨修復(fù)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究.pdf

1、目的：通過對TGF-β3促進(jìn)軟骨分化的基礎(chǔ)和應(yīng)用的研究，探究將TGF-β3應(yīng)用于臨床的軟骨修復(fù)的可能性，力圖尋找生物細(xì)胞因子用于臨床治療軟骨損傷成熟的方案。
　　 方法：首先，從原代培養(yǎng)骨髓細(xì)胞形成的單克隆中，應(yīng)用顯微操作技術(shù)挑取單克隆來源的MSCs，然后在有飼養(yǎng)層細(xì)胞(feeder cells FCs)的條件下，進(jìn)行大量擴(kuò)增，在傳代至P20(Passage 20)時進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志(STRO-1、CD34、CD45、OCT-4

2、、CD105、Nestin)的流式鑒定，并進(jìn)行這種單克隆來源的MSCs向骨、軟骨、肌腱和神經(jīng)樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)。其次，在TGF-β3促進(jìn)MSCs向軟骨分化的不同時間點(diǎn)，通過Western Blot檢測Erk1/2(extracellular signal-regulated kinase-1/2 Erk1/2)磷酸化的表達(dá)，然后再用Erk1/2磷酸化抑制劑U206處理誘導(dǎo)分化過程中的MSCs，RealTime-PCR檢測軟骨分化基因(Sr

3、y-trype HMG box protein 9)Sox9、膠原Ⅱ(collagen COLⅡ)和Aggrecan(Agc)的表達(dá)的變化；之后構(gòu)建Smad4在磷酸化位點(diǎn)Thr277突變的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MSCs后在分化過程中檢測上述基因表達(dá)的變化。再次，從大鼠的胚胎(胚芽)中提取TGF-β3基因全長，克隆到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建出表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TGF-β3，轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrow stem

4、 cell MSCs)，觀察轉(zhuǎn)染后MSCs向軟骨細(xì)胞分化的效應(yīng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的MSCs接種于載體脫鈣骨基質(zhì)(Decalcified bone matrix DBM)后移植于軟骨缺損的動物模型中，觀察轉(zhuǎn)染后MSCs體內(nèi)修復(fù)軟骨的能力。接著，應(yīng)用基因工程的方法改進(jìn)自然TGF-β3蛋白，構(gòu)建工程化TGF-β3的表達(dá)載體pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3，將基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteina

5、se MMP)酶切位點(diǎn)分別插入到前體相關(guān)蛋白(Latent Associated Protein LAP)和成熟TGF-β3(mature TGF-β3 mTGF-β3)之間，并分別轉(zhuǎn)染MSCs和軟骨前體細(xì)胞(Chondrogenic progenitor Cells CPCs)，檢測上述轉(zhuǎn)染后的兩種細(xì)胞球團(tuán)培養(yǎng)(pellet culture)過程中在有MMP酶和無MMP酶的條件下COLⅡ，Agc和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissu

6、e inhibitor of metalloproteinase TIMP)的表達(dá)和軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖Proteoglycan的積累。最后，人工合成GADD45-β的反義核苷酸，在TGF-β3促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的后期進(jìn)行干預(yù)，并檢測GADD45-β的反義核苷酸干預(yù)后對軟骨終末分化因子基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和膠原Х(co

7、llagenХ COLХ)表達(dá)的影響，以及對軟骨基質(zhì)中proteoglycan積累的影響。
　　 結(jié)果：我們成功獲得了由一個單克隆MSCs擴(kuò)增出來的大量單克隆來源的MSCs，而且這種單克隆來源的MSCs能被成功的誘導(dǎo)向骨、軟骨、肌腱和神經(jīng)樣細(xì)胞分化。Western blot檢測結(jié)果顯示Erk1/2的磷酸化在TGF-β3誘導(dǎo)MSCs向軟骨分化的過程中隨著時間增加而增加，同時Erk1/2磷酸化特異性的阻滯劑U206能夠成功減弱TGF

8、-β3誘導(dǎo)的軟骨分化和軟骨基質(zhì)的合成；而Erk1/2磷酸化底物Smad4在Thr277上的突變亦能減弱TGF-β3誘導(dǎo)的軟骨分化，效果與U206類似。接著，我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-TGF-β3并在MSCs中獲得了成功和高效的表達(dá)，在接下來的細(xì)胞球團(tuán)培養(yǎng)(pellet culture)中，轉(zhuǎn)染后的MSCs成功和高效被誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-TGF-β3的MSCs以DBM為載

9、體成功修復(fù)了動物模型中的大面積軟骨缺損。接下來，我們還成功構(gòu)建了工程化TGF-β3的真核表達(dá)載體pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3，并在MSCs和CPCs中成功獲得了表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染后的MSCs和CPCs只在有MMP酶的條件下能被特異性的促進(jìn)向軟骨細(xì)胞分化。最后，GADD45-β反義寡核苷酸對GADD45-β表達(dá)的封閉能夠成功阻滯TGF-β3誘導(dǎo)MSCs向軟骨分化后期軟骨細(xì)胞的終末分化，并維持和增加軟骨基質(zhì)的積累。

10、>　　 結(jié)論：單克隆來源的MSCs能被成功的誘導(dǎo)向中胚層和外胚層的組織細(xì)胞分化，這直接證明了MSCs的“橫向分化能力”，也獲得了大量的可供利用的均質(zhì)MSCs；Smad4基因在Thr277上的磷酸化是TGF-β3誘導(dǎo)軟骨分化中Erk1/2信號途徑促進(jìn)軟骨分化的關(guān)鍵；TGF-β3轉(zhuǎn)染MSCs后能成功的應(yīng)用于大面積軟骨缺損的修復(fù)；經(jīng)過基因工程改造后的工程化的TGF-β3蛋白則更能特異性修復(fù)受損的軟骨；而GADD45-β是TGF-β3誘導(dǎo)軟骨