TGF-β3與牙髓干細(xì)胞在動物面神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　面神經(jīng)的損傷在臨床上較為常見，且損傷后很少能達(dá)到完美的功能恢復(fù)，嚴(yán)重影響患者及家屬的心身健康及生活質(zhì)量。隨著干細(xì)胞研究的深入，利用骨髓干細(xì)胞對脊髓和顱腦損傷的治療頻頻見于文獻(xiàn)報道，但利用干細(xì)胞進(jìn)行外周神經(jīng)損傷的治療報道較少。本研究旨在通過動物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)觀察DPSCs與TGF-β3聯(lián)合干預(yù)對于面神經(jīng)損傷的修復(fù)效果，并探討其作用機(jī)制，為治療面神經(jīng)損傷提供新的方法。
　　方法：
　?。?）從新西蘭幼兔前

2、牙及磨牙牙髓組織中分離DPSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，測定細(xì)胞克隆形成率、生長曲線、細(xì)胞爬片行HE染色、抗Vimentin、抗osteonectin、抗DSP、抗CD44免疫組化染色，鑒定DPSCs的增殖能力和多分化潛能的生物學(xué)特征。
　?。?）12只普通級瞬目反射正常的成年健康新西蘭大白兔，面部兩側(cè)自身對照，隨機(jī)分為自身正常對照組和上頰支缺損模型組，各組l2側(cè)。于建模后7d、14d分別行光鏡、電鏡組織病理學(xué)檢測，結(jié)合動物行為學(xué)觀察、神經(jīng)

3、電生理檢測技術(shù)對面神經(jīng)上頰支缺損模型進(jìn)行評價。
　?。?）成年健康新西蘭大白兔48只（共96側(cè)面神經(jīng)），隨機(jī)抽取24只（共48側(cè)面神經(jīng)）右側(cè)設(shè)為TGF-β3+DPSCs實(shí)驗(yàn)組（共24側(cè)面神經(jīng)），左側(cè)設(shè)為TGF-β3對照組1組（共24側(cè)面神經(jīng)），另外24只新西蘭大白兔（共48側(cè)面神經(jīng)）右側(cè)設(shè)為正常對照組（共24側(cè)面神經(jīng)），左側(cè)設(shè)為PBS對照組2（共24側(cè)面神經(jīng)），分別制作面神經(jīng)上頰支7mm缺損、損傷局部硅膠管套接的動物模型。于術(shù)后1

4、周、1月、3月分別行大體形態(tài)、光鏡、電鏡組織學(xué)觀察、神經(jīng)電生理檢測、GFAP和S100免疫組織化學(xué)染色等檢測。
　　結(jié)果：
　　第一部分：1）原代培養(yǎng)的幼兔牙髓細(xì)胞多呈成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，少數(shù)紡錘形或多角形，光鏡下傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)與原代培養(yǎng)無明顯差異；從第1代到第3胞活率細(xì)胞數(shù)比分別為：94.7％、95.8%、95.2%；牙髓干細(xì)胞在低密度接種后能夠形成克隆，幼兔牙髓細(xì)胞克隆集落形成率為10-21個/103細(xì)胞；2）幼兔

5、牙髓細(xì)胞體外多次傳代仍具有良好的增殖能力，24孔板計(jì)數(shù)法表明兔牙髓細(xì)胞潛伏期短，隨后進(jìn)入對數(shù)增長期，選取的第三代細(xì)胞均在五天達(dá)到對數(shù)生長期，約在第8天細(xì)胞達(dá)到平臺期；細(xì)胞周期的測定結(jié)果為：G1期DNA含量占80.4%；G2期DNA含量占15.3%；S期DNA含量占4.3%；3）原代和次代克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)對未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志物Vimentin、CD44、osteonectin、dsp鑒定，結(jié)果均為染色陽性。
　　第二部分：

6、1）12只實(shí)驗(yàn)動物建模過程均較順利，術(shù)中面神經(jīng)暴露良好，操作可重復(fù)性佳。切口均獲得I期愈合，動物在研究期間未發(fā)生切口感染及并發(fā)癥，無實(shí)驗(yàn)兔死亡，動物存活率100%，建模成功率達(dá)100%；2）建模后所有實(shí)驗(yàn)動物術(shù)側(cè)均出現(xiàn)面神經(jīng)麻痹癥狀，2周時術(shù)側(cè)面部輕度萎縮，兔唇明顯偏向健側(cè)；術(shù)后2周面部胡須運(yùn)動功能評分，術(shù)側(cè)分值為0.25±0.05，與健側(cè)分值4分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-249.16，P＜0.05）；3）面神經(jīng)電生理檢測結(jié)果顯示，

7、建模后1周、2周時，實(shí)驗(yàn)兔健側(cè)組正常面神經(jīng)潛伏期為（1.47±0.42）ms，神經(jīng)動作電位最大波幅為（11.32±5.36）mV；刺激術(shù)側(cè)組面神經(jīng)中樞側(cè)斷端，不能引起同側(cè)上唇方肌收縮；實(shí)驗(yàn)兔術(shù)側(cè)面神經(jīng)動作電位均未能引出；4）健側(cè)組面神經(jīng)HE染色可見，正常面神經(jīng)上頰支纖維呈長條形，排列整齊，髓鞘密集，無退變，神經(jīng)外膜連續(xù)；手術(shù)組面神經(jīng)斷端可見神經(jīng)纖維連續(xù)性中斷，斷端部分脫髓鞘改變，神經(jīng)外膜松散，神經(jīng)纖維腫脹，板狀層結(jié)構(gòu)疏松，軸突呈空泡狀；

8、5）電鏡觀察顯示，正常面神經(jīng)軸突排列整齊，均勻一致，髓鞘結(jié)構(gòu)完整、厚度較均勻、呈致密板層排列，胞核清晰；術(shù)后1周模型組神經(jīng)鞘膜解離，板狀結(jié)構(gòu)變得模糊以致消失形成橢圓形小體，出現(xiàn)神經(jīng)纖維球，軸漿內(nèi)呈低電子密度；術(shù)后2周模型組軸突明顯腫脹，其內(nèi)微管、微絲數(shù)目明顯減少，線粒體腫脹呈空泡樣，電子密度降低；神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)外膜連續(xù)性中斷板層脫離。
　　第三部分：1）術(shù)后3月大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組1、2比較，實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)直徑與近、

9、遠(yuǎn)端神經(jīng)干相當(dāng)，無神經(jīng)瘤形成，外膜血管豐富，質(zhì)地堅(jiān)韌；2） HE染色，術(shù)后3月實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維排列較整齊，胞核濃密，束間血管多；對照組1神經(jīng)纖維萎縮，再生神經(jīng)纖維較少，扭曲較明顯，呈盤旋狀；對照組2部分軸突消失，神經(jīng)纖維排列紊亂、髓鞘厚薄不均；3）電鏡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的再生纖維以有髓神經(jīng)纖維為主，形態(tài)規(guī)則，髓鞘板層結(jié)構(gòu)清晰，軸漿內(nèi)細(xì)胞器豐富；對照組1再生纖維髓鞘發(fā)育稍差，有髓神經(jīng)纖維形態(tài)較規(guī)則，軸漿內(nèi)細(xì)胞器較豐富；對照組2再生纖維髓鞘發(fā)育不

10、良，板層結(jié)構(gòu)紊亂，有髓神經(jīng)纖維形態(tài)不規(guī)則，可見到變性的神經(jīng)纖維；4）圖像分析顯示，實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)纖維總數(shù)多于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)纖維直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)髓鞘厚度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5）神經(jīng)電生理檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)肌肉動作電位的潛伏期明顯短于其他兩個對照組[實(shí)驗(yàn)組（1.96±0.32）ms，對照組1（

11、2.35±0.41） ms，對照組2（3.42±0.55）ms，P＜0.05]，而實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)肌肉動作電位的波幅明顯高于其他兩個對照組[實(shí)驗(yàn)組（11.06±3.25）mv，對照組1（8.40±1.68）mv，對照組2（4.62±0.77）mv，P＜005]；6）免疫組化結(jié)果顯示，各處理組面神經(jīng)核中均出現(xiàn)GFAP陽性細(xì)胞，且術(shù)后7天GFAP陽性細(xì)胞數(shù)TGF-β3+DPSCs實(shí)驗(yàn)組＞TGF-β3對照組1＞PBS對照組2（P＜0.05）；各處理

12、組面神經(jīng)中均出現(xiàn)S100陽性細(xì)胞，且S100陽性細(xì)胞數(shù) TGF-β3+DPSCs實(shí)驗(yàn)組＞TGF-β3對照組1＞PBS對照組2（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　（1）本研究所培養(yǎng)的DPSCs增殖能力強(qiáng)，具有穩(wěn)定的生物活性，可適應(yīng)長期大量培養(yǎng)的需要。
　?。?）在傳代第一代、第二代及第三代形成的克隆細(xì)胞率最高，可以選擇前三代形成的克隆球進(jìn)行細(xì)胞移植治療。
　　（3）本研究建立的兔面神經(jīng)上頰支缺損動物模型，制作簡便、