基于SAGE數(shù)據(jù)庫挖掘技術(shù)篩選分析前列腺癌相關(guān)新基因.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成，人們迎來了以轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)為核心內(nèi)容的后基因組(功能基因組)時(shí)代。研究人類基因功能最后注解基因以揭示生命活動(dòng)機(jī)理是今后生物醫(yī)學(xué)研究至為重要而艱巨的任務(wù)。通過研究腫瘤差異表達(dá)基因的功能來闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理也是腫瘤研究的重要工作。前列腺癌為全世界特別是歐美國家男性常見的惡性腫瘤和主要死亡原因之一。我國隨著人口老齡化、生活習(xí)慣的改變及醫(yī)療檢測水平的提高，發(fā)病率逐年提高。篩選并研究前列腺癌與正常組織的

2、差異表達(dá)基因，不僅可幫助闡明前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理，而且可為臨床提供有價(jià)值的診斷指標(biāo)及治療的靶基因。基因表達(dá)高通量研究技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，有力地推動(dòng)了前列腺癌相關(guān)基因的研究。隨著美國癌癥基因組解剖計(jì)劃(CGAP)的實(shí)施，美國NCBI收錄了大量來自不同的正常及腫瘤組織的基因表達(dá)系列分析(SAGE)數(shù)據(jù)庫，分別通過CGAP提供的免費(fèi)在線分析軟件就可以比較任意數(shù)據(jù)集組合之間的基因差異表達(dá)，進(jìn)一步深入分析而得到相關(guān)腫瘤與正常組織的差異表

3、達(dá)基因。這種“硅片實(shí)驗(yàn)”的分析結(jié)果都需要生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但它卻可以給研究者大量的實(shí)驗(yàn)提示并減少實(shí)驗(yàn)工作。因此，用公眾數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌相關(guān)基因，然后用生物醫(yī)學(xué)方法證實(shí)，最后針對興趣基因進(jìn)行功能研究并解釋與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。不僅能為功能基因組學(xué)的注釋基因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且可為發(fā)現(xiàn)前列腺癌新的診斷方法及治療途徑奠定重要的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 通過選擇合理的數(shù)據(jù)庫及統(tǒng)計(jì)參數(shù)，利用NCBI提供SAGE數(shù)據(jù)庫

4、及分析軟件獲得在前列腺癌組織相對正常組織差異表達(dá)超過5倍SAGE標(biāo)簽，然后進(jìn)行標(biāo)簽篩選、標(biāo)簽對基因電子確認(rèn)及GLGI確認(rèn)，最后注釋差異表達(dá)基因的主要功能及與前列腺癌的關(guān)系并確定進(jìn)一步研究的興趣基因。同樣方法得到在男性全身臟器組織中優(yōu)勢表達(dá)于前列腺組織的一系列基因，并確定進(jìn)一步研究的興趣基因。針對在前列腺優(yōu)勢表達(dá)的新基因LOC389816，用RT-PCR在男性的主要臟器組織中驗(yàn)證其表達(dá)情況，同時(shí)用生物信息學(xué)方法對新基因LOC389816進(jìn)

5、行序列分析及功能預(yù)測。針對前列腺癌新的上調(diào)表達(dá)基因BRP44，NorthernBlot分析驗(yàn)證在前列腺腺瘤及癌組織標(biāo)本的差異表達(dá)，同時(shí)用生物信息學(xué)方法對基因BRP44進(jìn)行序列分析及功能預(yù)測；構(gòu)建BRP44與GFP融和表達(dá)真核載體，轉(zhuǎn)染高表達(dá)該基因的前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位；體外轉(zhuǎn)錄法合成BRP44的siRNAs，轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞系降低BRP44的基因表達(dá)，觀察LNCaP細(xì)胞在BRP44表達(dá)降低

6、后細(xì)胞生長增殖曲線、細(xì)胞周期分布及分泌PSA的量的變化以初步了解BRP44在LNCaP細(xì)胞中可能的功能。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1)得到代表前列腺癌差異表達(dá)基因的可靠SAGE標(biāo)簽55條，分別代表著28條上調(diào)表達(dá)和27條下調(diào)表達(dá)基因，其中23條基因未見文獻(xiàn)報(bào)道與前列腺癌相關(guān)，可能為新的前列腺癌相關(guān)基因。確定功能完全未知的BRP44基因?yàn)檫M(jìn)一步研究的興趣基因。得到代表前列腺優(yōu)勢表達(dá)基因的可靠標(biāo)簽13條，其中9條已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，另外4條

7、有希望成為前列腺新的優(yōu)勢表達(dá)基因。確定功能完全未知的LOC389816為進(jìn)一步研究的興趣基因。用GLGI方法從30條不確定SAGE標(biāo)簽中獲得2條cDNA片段，可能為在前列腺癌中上調(diào)表達(dá)的序列未知新基因或者某基因新的剪接體。 2)RT-PCR證實(shí)：在正常人的心、肝、結(jié)腸、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺、皮膚、胃、腎臟、脾臟及胰腺共12種組織中，只在前列腺組織中檢測到了LOC389816基因的表達(dá)。生物信息學(xué)分析提示，LOC389816表

8、達(dá)的蛋白產(chǎn)物可能是一個(gè)具有信號(hào)傳導(dǎo)活性的膜受體蛋白。 3)NorthernBlot分析了10例前列腺癌組織，2個(gè)前列腺癌細(xì)胞系(PC-3及LNCaP)及8例前列腺腺瘤組織。結(jié)果證實(shí)BRP44在前列腺癌組織的表達(dá)豐度高于良性前列腺腺瘤組織，BRP44在LNCaP細(xì)胞中高表達(dá)而在PC-3中不表達(dá)。生物信息學(xué)方法初步推斷BRP44可能是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄或者翻譯水平控制腫瘤細(xì)胞線粒體某些基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。GFP-BRP44融和蛋白在LNC

9、aP的細(xì)胞核及細(xì)胞漿均有表達(dá)，在胞漿的表達(dá)相比胞核更強(qiáng)。BRP44-siRNAs轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞24h后可以降解BRP44mRNA近60％，轉(zhuǎn)染48h后LNCaP細(xì)胞生長增殖加快，同時(shí)S期細(xì)胞顯著增加，而G0+G1、G2+M期細(xì)胞相應(yīng)降低；但LNCaP細(xì)胞分泌PSA的量沒有變化。 結(jié)論： 1)利用公用生物信息學(xué)資源，基于SAGE數(shù)據(jù)庫挖掘技術(shù)篩選前列腺癌相關(guān)基因是一個(gè)相對簡單而可行的方法，可以為發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌相關(guān)基因

10、提供線索。 2)基因LOC389816是一個(gè)在前列腺優(yōu)勢表達(dá)的新基因，其蛋白產(chǎn)物可能是一個(gè)具有信號(hào)傳導(dǎo)活性的膜受體蛋白，有希望成為前列腺癌診斷及治療的癌標(biāo)。 3)BkP44是一個(gè)與前列腺癌相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因，其蛋白產(chǎn)物在LNCaP的細(xì)胞核及細(xì)胞漿均有表達(dá)，但在胞漿的表達(dá)相比胞核更強(qiáng)。BRP44可能是一個(gè)調(diào)控腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。BRP44對LNCaP細(xì)胞的生長增殖起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在LNCaP細(xì)胞合成P