非B細(xì)胞來源IgκV區(qū)保守序列特異性抗體的制備及鑒定.pdf

1、免疫球蛋白(Ig)是重要的免疫分子，其兩種存在方式分別為：膜型和分泌型，前者作為B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體在抗原識(shí)別、細(xì)胞的活化、分化甚至程序性細(xì)胞死亡中起重要作用；后者主要存在與血液及其它體液中的，能夠與相應(yīng)抗原相結(jié)合發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能。經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為，Ig的來源為B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞，Ig基因僅在B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中成功進(jìn)行選擇性重排，而在其它體細(xì)胞中該基因處于胚系狀態(tài)，或者僅能發(fā)生不完全的重排，即不發(fā)生功能性基因重排，故不會(huì)有I

2、g分子的產(chǎn)生。 2003年，北京大學(xué)邱曉彥教授課題組在CancerResearch發(fā)表論文證實(shí)上皮來源腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生Ig分子，該工作被評(píng)為2004年中國(guó)醫(yī)藥研究領(lǐng)域十大新聞之一。其工作證明了除B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞外，在一些非免疫細(xì)胞，如上皮來源的腫瘤細(xì)胞(如肺癌、卵巢癌、腸癌、鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等)及部分正常的上皮細(xì)胞內(nèi)Ig基因同樣存在功能性基因重排，并可以產(chǎn)生Ig分子，因此現(xiàn)將其稱為非B細(xì)胞來源Ig(nonB-Ig)；

3、此外，更重要的是該課題組通過對(duì)nonB-Ig分子功能的研究，表現(xiàn)在基因及蛋白質(zhì)水平抑制癌細(xì)胞Ig分子的表達(dá)或封閉其活性，則癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱。上述現(xiàn)象將有可能使人們重新定義Ig分子的來源及其潛在的、有別于經(jīng)典Ig的生物學(xué)活性，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。同時(shí)，也將對(duì)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)研究以及以腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Ig分子做為靶點(diǎn)的腫瘤生物治療研究產(chǎn)生重要的影響?？上驳氖牵荁細(xì)胞能夠產(chǎn)生Ig的現(xiàn)象已逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所證實(shí)與認(rèn)同。 已知

4、，B細(xì)胞來源的Ig具獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，主要表現(xiàn)在：其可變區(qū)(V區(qū))識(shí)別特定的抗原決定簇，不同的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生不同的IgV區(qū)結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成了Ig分子的多樣性，使得免疫系統(tǒng)能夠應(yīng)對(duì)自然界不同的抗原；其恒定區(qū)與一組特定的分子(如Fc受體、信號(hào)傳導(dǎo)分子、補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)成分)相結(jié)合，行使Ig分子的效應(yīng)功能。根據(jù)恒定區(qū)的不同，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Ig分子根據(jù)重鏈不同被分為五類，分別是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE；其輕鏈則分為K與λ型。

5、 B細(xì)胞來源的Ig分子的可變區(qū)序列呈高度多樣性，這是構(gòu)成抗體及BCR多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。對(duì)非B細(xì)胞來源的Ig基因研究結(jié)果顯示，與經(jīng)典的Ig分子相似，這些nonB-Ig分子的重鏈及輕鏈編碼基因均發(fā)生了典型的基因重排及轉(zhuǎn)錄。但在其V-D-J或V-J序列、體細(xì)胞突變特點(diǎn)和類別轉(zhuǎn)換等方面均呈現(xiàn)出與經(jīng)典Ig分子不同的特征。邱曉彥教授課題組借助激光顯微切割(LCM)及RT-PCR技術(shù)，證明所有腫瘤細(xì)胞來源的Ig分子V-D-J或V-J片段組合方式有明顯

6、的傾向性。表現(xiàn)在同一個(gè)體的不同細(xì)胞克隆、甚至不同個(gè)體腫瘤來源的Ig序列之間高度同源，甚至完全相同，并且這些序列在B淋巴細(xì)胞表達(dá)的Ig數(shù)據(jù)庫(kù)中均無記錄，提示這些序列的確是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的。更令人驚奇的是，所有腫瘤細(xì)胞均表達(dá)序列完全相同或極其相似的(個(gè)別堿基的替換)重排模式，即VK4-1/JK3型IgK轉(zhuǎn)錄本(專利申請(qǐng)?zhí)枮?00510107833.9)。這一現(xiàn)象提示，這些序列特點(diǎn)與組織類型無關(guān)，它們可能在不同的組織中發(fā)揮著相似的作用。

7、 根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，作為與北京大學(xué)邱曉彥教授的合作項(xiàng)目，本研究的主要目的是制備這種保守的K鏈可變區(qū)抗體。我們根據(jù)其特有VK4-1/JK3氨基酸序列，對(duì)比胚系基因可變區(qū)序列，綜合考慮氨基酸組成、疏水性、抗原性、表面暴露性等因素，利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)了VK4-1/JK3型IgK兩個(gè)較為特異的B細(xì)胞識(shí)別表位，設(shè)計(jì)并合成三個(gè)短肽AL13(序列ASINCKSSQRVSL)、OF20(QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF)，AL13B(TQS

8、PDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG，即AL13的延長(zhǎng)序列)。同時(shí)獲得由邱曉彥教授課題組提供的原核表達(dá)VK4-1/JK3型IgK純化融合蛋白(GST-VK4-1-JK3)。本實(shí)驗(yàn)分別以合成肽AL13、QF20交聯(lián)載體免疫家兔獲得單表位特異性多克隆抗體；分別以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-VK4-1-JK3免疫小鼠獲得系列單克隆抗體抗。再通ELISA、WesternBlot、流式細(xì)胞術(shù)等方法鑒定了抗體的效價(jià)和特異

9、性，為后續(xù)研究提供了有效工具。 第一章VK4-1-JK3型IgKV區(qū)特異性單表位多抗的制備及鑒定 將合成肽AL13、QF20分別與載體蛋白交聯(lián)制備免疫原，免疫新西蘭大白兔獲得相應(yīng)抗血清，經(jīng)ELISA檢測(cè)其抗體滴度分別為0.3×10-5和0.6×10-5。運(yùn)用親和層析方法對(duì)兔血清進(jìn)行純化，得到anti-AL13和anti-QF20單表位特異性多抗。ELISA結(jié)果顯示，所得抗體與合成肽特異性結(jié)合，但不與正常人IgG反應(yīng)。為了

10、進(jìn)一步證明所得抗體的特異性，以原核表達(dá)蛋白GST-VK4-1-JK3(39kD)和V5-51-VK4-1-JK3-pRA(34kD)作為抗原進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，結(jié)果顯示anti-AL13和anti-OF20都能夠正確識(shí)別含VK4-1-JK3序列的原核表達(dá)蛋白，在預(yù)期位置上都有明確的條帶出現(xiàn)，但基本不與商品化的人IgG的輕鏈結(jié)合；用anti-AL13檢測(cè)HT-29細(xì)胞中內(nèi)源性IgK的表達(dá)，結(jié)果顯示anti-AL13的陽(yáng)性信號(hào)主

11、要在HT-29細(xì)胞不可溶成分中(僅少量的存在于可溶性組分中)，這種與經(jīng)典Ig分子完全不同的細(xì)胞內(nèi)定位，提示其可能具有不同于經(jīng)典Ig分子的生物學(xué)活性。 第二章VK4-1-JK3型IgKV區(qū)特異性單克隆抗體的制備及鑒定 以合成肽AL13B-KLH作為免疫原免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合制備雜交瘤，經(jīng)合成肽和原核表達(dá)蛋白(GST-VK4-1-JK3)篩選和三次克隆化，并從制備的腹水中純化單克隆抗體，篩選后共

12、獲得3株(6G5、3H9.2、5D3)穩(wěn)定分泌針對(duì)VK4-1-JK3型IgK的抗體的雜交瘤細(xì)胞；同時(shí)以原核重組蛋白(GST-VK4-1-JK3)作為免疫原免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)篩選、克隆化后獲得1株(4E9)穩(wěn)定分泌針對(duì)VK4-1-JK3型IgK的抗體的雜交瘤細(xì)胞。這4株單抗的亞類分別為IgG1、IgG1、IgG1和IgG2b。將腹水單抗經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化，并用改良過碘酸鈉法對(duì)4株抗體標(biāo)記了辣根

13、過氧化物酶。ELISA鑒定結(jié)果顯示所得單抗均與合成肽及原核表達(dá)蛋白(GST-VK4-1-JK3)發(fā)生特異性結(jié)合。對(duì)合成肽AL13B-KLH來源的3株單抗的近一步ELISA鑒定結(jié)果顯示：這3株單抗與常用的載體蛋白KLH、BC、BSA、OVA均無交叉反應(yīng)，同時(shí)與商品化的人IgG、羊IgG、兔IgG、鼠IgG均不反應(yīng)；用流式細(xì)胞術(shù)鑒定上述單抗可與以人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生明顯的特異性結(jié)合，驗(yàn)證了VK4-1

14、-JK3型IgK的胞內(nèi)表達(dá)；與人末梢血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞均有高比例的結(jié)合。鑒于人與小鼠IgK的同源性高達(dá)70％，我們對(duì)靶抗原序列與小鼠IgKV區(qū)進(jìn)行了比對(duì)，用流式細(xì)胞術(shù)證明上述4株單抗可與小鼠腫瘤細(xì)胞系的胞內(nèi)蛋白有明顯結(jié)合；與小鼠脾細(xì)胞的部分細(xì)胞膜結(jié)合。用上述4株單抗鑒定人和小鼠細(xì)胞的VK4-1-JK3型IgK表達(dá)譜工作仍在進(jìn)行中。 第三章抗藍(lán)載體單克隆抗體的制備及特性鑒定 該部分是作為碩士研究生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室初期進(jìn)

15、行免疫學(xué)技能訓(xùn)練時(shí)完成的一項(xiàng)工作，并得以發(fā)表。藍(lán)載體(BlueCarrier，BC)是從軟體動(dòng)物Concholepasconcholepas中分離出的血藍(lán)蛋白，是鑰孔戚血藍(lán)素(Keyholelimpethemocyanin，KLH)的一種類似物。BC的溶解性與均一性明顯優(yōu)于KLH，作為合成肽以及半抗原免疫時(shí)的載體蛋白已被成功用于多克隆抗體以及單克隆抗體的制備。但此前國(guó)內(nèi)并無針對(duì)BC單抗的工作報(bào)道。本研究在制備抗短肽(以藍(lán)載體為交聯(lián)載體)