高成脂能力脂肪干細胞系的分離與純化.pdf

1、研究背景： 脂肪組織是修復(fù)全身各部位軟組織缺損的最佳選擇。臨床上自體成熟脂肪組織的移植，不論是脂肪塊或是脂肪顆粒的注射移植，均可能出現(xiàn)壞死、再吸收等問題，導(dǎo)致術(shù)后長期效果不佳。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，對組織器官的修復(fù)與替代治療產(chǎn)生了重大意義。 組織工程技術(shù)的首要條件就是種子細胞。由于胚胎干細胞受到倫理學(xué)和來源的限制，故目前使用最多的種子細胞即成體干細胞。作為種子細胞的成體干細胞主要有兩種來源，一是骨髓來源的骨髓干細胞(bon

2、emarrow-derivedstemcells，BMSCs)，另一種是脂肪組織來源的脂肪干細胞(Adipose-derivedstemcells，ASCs)。相對與BMSCs而言，ASCs取材容易，且細胞量足以滿足組織工程的需求，具有很大的優(yōu)勢。 但現(xiàn)有的研究表明，通過普通的酶消化法分離出來的ASCs是由極其復(fù)雜的各種細胞集合而成，成脂等各項誘導(dǎo)分化的能力及效率都不高。將ASCs進行成脂誘導(dǎo)后兩周，其分化比例只為30％～40％

3、，同時ASCs其余的各項分化效率也低于BMSCs。因此，純化ASCs，提高其誘導(dǎo)分化效率，是優(yōu)化其成為最佳種子細胞來源之一的有效方法。 近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，成熟脂肪細胞在某種環(huán)境中，可去分化回成纖維樣細胞狀態(tài)，這種退回到原始狀態(tài)的去分化細胞具有多向分化的潛能，且成脂分化能力要高于ASCs。然而這種去分化細胞的高成脂能力是否伴隨著某些表面標志的表達，國內(nèi)外均未見報道。所以，本實驗欲比較去分化脂肪細胞與ASCs在表面標志等各方面的不

4、同，尋求出高成脂細胞高表達的表面標志，并希望能通過免疫磁珠分選，提純出高成脂系A(chǔ)SCs。 目的： 探索尋求與高成脂能力相關(guān)的干細胞表面分子，并通過分選，純化得到高成脂系A(chǔ)SCs，從而為提高脂肪組織工程的效率提供有效途徑。 方法： 1、從人脂肪組織中分離培養(yǎng)ASCs，成脂誘導(dǎo)分化ASCs，得到誘導(dǎo)后脂肪細胞。收集誘導(dǎo)后漂浮于培養(yǎng)基中的脂肪細胞，天花板貼壁培養(yǎng)10d，脂肪細胞貼壁后翻轉(zhuǎn)正常培養(yǎng)得到去分化脂肪細

5、胞。選擇同等代數(shù)兩種細胞，成脂誘導(dǎo)分化并用油紅O染色法鑒定其分化效率；細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線；流式細胞術(shù)測定細胞的表面標志表達，并在上述三方面對ASCs和去分化脂肪細胞進行比較，篩選出可能與高成脂能力相關(guān)的表面分子。 2、就篩選出的可能與高成脂能力相關(guān)的表面分子，用免疫磁珠分選法分別分選脂肪組織新鮮分離的間質(zhì)血管碎片(stromalvascularfractions，SVF)及培養(yǎng)后ASCs。流式細胞檢測分選前后細胞群體該表

6、面分子陽性表達率；并對兩種分選出的細胞與未行分選的ASCs進行成脂、成骨誘導(dǎo)，濉工。染色鑒定成脂誘導(dǎo)結(jié)果，茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)結(jié)果。 結(jié)果： 從吸脂術(shù)中獲得人脂肪組織，培養(yǎng)出ASCs。選擇第4代ASCs進行成脂誘導(dǎo)，誘導(dǎo)13d起，收集誘導(dǎo)成熟的脂肪細胞，天花板貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，多房的脂肪細胞貼壁并逐漸吐出脂泡，最終去分化為成纖維狀細胞。去分化細胞與ASCs相比，生長曲線較一致說明兩者具有相似的增殖能力；油紅O染色鑒

7、定成脂誘導(dǎo)結(jié)果表明去分化細胞的成脂分化效率高出ASCs約50％。兩種細胞在表面標志的表達上，CD34、CD54的表達陽性率有所差別：去分化細胞的CD34、CD54的表達為陽性，而ASCs的表達均為陰性。 用CD54-PE免疫磁珠分選新鮮分離的SVF及經(jīng)過培養(yǎng)后的ASCs。分選前，流式檢測一至三代ASCs，細胞CD54的表達率隨著代數(shù)的增加而降低。分選后，CD54的表達率在兩種細胞群體中均達到90％以上。繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)代后，從培養(yǎng)后A

8、SCs分離出的CD54陽性細胞群體CD54表達率維持高水平，新鮮分離SVF中分離出的陽性細胞CD54的表達則降至陰性，未分選的ASCs為陰性表達。分選后的細胞與未分選的ASCs成脂能力比較：從培養(yǎng)后的ASCs分離出的CD54陽性細胞成脂分化率接近100％，未分選的ASCs成脂能力約為30％，而從新鮮分離的SvF中分選出的CD54陽性細胞成脂分化率只為10％左右。成骨誘導(dǎo)結(jié)果：ASCs成骨能力為三種細胞中最佳，而從SVF分選出的CD54陽

9、性細胞群的成骨效率最差。 結(jié)論： 1、本實驗通過比較去分化細胞與ASCs在增殖能力、成脂分化能力與表面標志表達等方面的差別，認為去分化細胞是一種類似于干細胞但較干細胞具有更高成脂分化能力的細胞。去分化細胞CD54、CD34的表達高于ASCs表明CD54、CD34的表達可能與高成脂能力相關(guān)。 2、CD54免疫磁珠分選經(jīng)過培養(yǎng)的ASCs，能純化ASCs并分離出高成脂系干細胞。因而，CD54應(yīng)是高成脂系干細胞特異表達的