肝癌抗血管形成和放射治療的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的 實(shí)體性腫瘤在其發(fā)展過程中都有大量的腫瘤新生血管形成，血管形成是腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。原發(fā)性肝細(xì)胞癌是臨床常見惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，對傳統(tǒng)治療方法反應(yīng)差，預(yù)后不佳；腫瘤血管形成活躍也是其突出的特征。血管形成是在多種生長因子的調(diào)控下實(shí)現(xiàn)的，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管形成的主要調(diào)控因子，它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和血管構(gòu)建，誘導(dǎo)血管形成；抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；增加新生血管通透性；誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)

2、和基底膜分解酶表達(dá)升高或活性增強(qiáng)。VEGF在腫瘤血管形成和瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中具有至關(guān)重要的作用。 肝癌的傳統(tǒng)治療方法有手術(shù)切除、放射治療和介入等，手術(shù)是最有效的根治性治療措施，但臨床上大部分病人就診時(shí)已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。肝癌對化療不敏感，肝癌細(xì)胞對放療也不敏感，而肝臟卻是放射敏感器官。隨著放療設(shè)備和技術(shù)的進(jìn)步，肝癌的放療療效有了極大的提高，但肝癌的高轉(zhuǎn)移特性制約了作為局部治療措施的放療的作用，放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡

3、的主要原因。因而尋求更有效的治療方法延長肝癌患者的生存期，是臨床迫切的需要。 有大量實(shí)驗(yàn)研究表明，抗血管形成治療能抑制多種腫瘤生長，但其作用是暫時(shí)的。放療與抗血管形成治療聯(lián)合對一些腫瘤的協(xié)同抑制作用已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但聯(lián)合治療肝癌的研究未見報(bào)道。我們利用肝癌血管形成豐富的特點(diǎn)，應(yīng)用外照射放療與抗VEGF抗體(VEGFmAb)聯(lián)合治療肝癌裸鼠移植瘤，觀察聯(lián)合治療對腫瘤生長和血管形成的抑制作用，初步探討它們協(xié)同抑制腫瘤生長和抗血管形成

4、的作用機(jī)制。同時(shí)檢測肝癌臨床手術(shù)切除標(biāo)本中與血管形成有關(guān)的VEGF、缺氧誘生因子1a(HIF-1a)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)，了解它們與肝癌臨床發(fā)病特征及術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和生存時(shí)間的聯(lián)系，為新的肝癌治療策略提供部分理論依據(jù)。 方法 抗血管形成治療劑采用鼠抗人VEGF165中和性單克隆抗體(抗VEGFmAb)。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721實(shí)驗(yàn)室繁殖傳代，收集指數(shù)生長期細(xì)胞，以生理鹽水定容細(xì)胞密度為2×107個(gè)

5、/ml，取0.2ml(含4×106個(gè)細(xì)胞)懸液種植于裸小鼠右后肢皮下。待皮下腫瘤直徑長至5mm左右時(shí)，將25只腫塊大小較為一致的動(dòng)物隨機(jī)分為5組：單純放療20Gy組(A組)、放療20Gy+抗體組(B組)、放療30Gy+抗體組(C組)、單純抗體組(D組)和對照組(E組)，每組動(dòng)物5只。抗VEGFmAb按25μg/只/次腹腔注射給藥，隔日1次，共6次；第4次給藥后放療。放療采用6MeV電子線，劑量率4Gy/min，全部放射劑量一次性給予。治

6、療開始后觀察記錄腫瘤生長情況，隔日測量1次腫瘤的最大長徑和短徑，求體積。治療結(jié)束后2周處死動(dòng)物，稱瘤重。取腫瘤組織以福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，免疫組化SABC法測VEGF、HIF-1a、MMP-2和CD31的表達(dá)，CD31作為微血管密度(MVD)的指標(biāo)，一抗為兔源性多克隆抗體，1∶100稀釋，二抗是生物素化羊抗兔抗體，DAB染色，依據(jù)陽性細(xì)胞染色程度和細(xì)胞染色率的評分作為判斷陽性染色標(biāo)準(zhǔn)；DNA末端原位標(biāo)記染色法測凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡

7、指數(shù)。具體操作均按說明書進(jìn)行。 臨床部分，取55例經(jīng)病理證實(shí)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織切片，免疫組化方法檢測腫瘤組織中VEGF、HIF-1a和MMP-2的表達(dá)程度和表達(dá)率。隨訪術(shù)后患者生存時(shí)間和復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況，分析患者臨床發(fā)病特征、VEGF、HIF-1a和MMP-2與術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間的聯(lián)系。 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件分析。 結(jié)論 1.VEGF是肝癌血管形成的關(guān)鍵生長因子，放療或抗VEGFmAb單獨(dú)

8、治療抑制移植瘤生長和抗血管形成作用有限。放療和抗VEGFmAb聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同抑瘤效應(yīng)，協(xié)同作用的機(jī)制是抗VEGFmAb阻斷血管形成、誘導(dǎo)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、對抗放療誘導(dǎo)的腫瘤保護(hù)，起到了放射增敏作用；而放療的細(xì)胞毒作用彌補(bǔ)了抗VEGFmAb不能直接殺滅腫瘤細(xì)胞的不足。 2.VEGF、HIF-1a和MMP-2與臨床肝癌轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)、腫瘤生長密切相關(guān)，是影響肝癌術(shù)后總生存時(shí)間及無瘤生存時(shí)間的關(guān)鍵因素之一。VEGF、HIF-1a和M

9、MP-2的表達(dá)互相促進(jìn)。 3.本文首次應(yīng)用外照射放療與抗血管形成劑(抗VEGFmAb)治療肝癌裸小鼠移植瘤，證實(shí)了兩種治療措施的協(xié)同抗腫瘤生長效應(yīng)，并初步探討了兩者發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制，為新的肝癌治療策略提供了部分實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。臨床肝癌組織血管形成豐富，放療聯(lián)合抗血管形成治療肝癌的前景遠(yuǎn)大。 4.抗血管形成治療腫瘤的研究仍處于起步階段，與放療聯(lián)合治療肝癌則罕有報(bào)道。在放療劑量的選擇、劑量分割分式、抗血管形成劑的劑量及與放療