應用雙向熒光差異凝膠電泳和質譜技術篩選口腔扁平苔蘚唾液差異蛋白.pdf

1、目的:口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種常見的口腔黏膜疾病，病因不明，易反復發(fā)作，有一定的癌變傾向，被世界衛(wèi)生組織(WHO)定義為癌前狀態(tài)。在我們前期研究中，應用基因芯片技術篩選出142個差異表達基因，而基因是通過指導蛋白質的合成來進行表達。隨著人類基因組測序計劃的完成，研究重點逐漸轉向功能基因組學，然而僅憑基因DNA序列及其表達仍不足以解決基因表達時間及表達量甚至蛋白質的翻譯后加工及修飾等情況，因此，這

2、些基因組學不能解決的問題可以在蛋白質組學的研究中找到答案。目前，隨著蛋白質組學技術的發(fā)展，其研究越來越多地應用到生命科學、醫(yī)學等各個領域，尤其是在研究疾病的病因及發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。以往采用雙向凝膠電泳技術研究扁平苔蘚差異蛋白的方法誤差較大，蛋白定量不準確，而且蛋白質組學對組織和血液研究較多，對唾液的研究較少。而唾液取材的簡便、安全、低成本和無創(chuàng)性以及含有許多有助于疾病早期診斷的蛋白質，使得唾液的蛋白質組學研究發(fā)展受到人們的關注，

3、但是由于唾液的蛋白質種類較多，蛋白質濃度相差較大，對于唾液蛋白的提取沒有統(tǒng)一標準和規(guī)范，還需要進一步探索。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳和質譜技術篩選、鑒定與口腔扁平苔蘚患者唾液有關的差異蛋白，以探討唾液中某些相關蛋白質表達量的變化與口腔扁平苔蘚發(fā)生的可能作用機制。
　　方法:
　　1提取唾液蛋白預試驗
　　分別采用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法及2-D Clean-Up Kit的方法提取新鮮唾液蛋白，并將苯酚

4、抽提復溶后的蛋白經超聲處理50s，通過觀察十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶，確定提取唾液蛋白的最適方法。
　　2唾液蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
　　收集9例口腔扁平苔蘚患者及9例正常人唾液，為了減少個體差異對本研究的影響，分別將每組3例唾液混合，作為一個試驗樣品。按照2-DClean-Up Kit說明書操作提取唾液總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶觀察

5、唾液蛋白的提取情況。
　　3雙向熒光差異凝膠電泳技術分離蛋白質、質譜技術鑒定差異蛋白
　　采用雙向熒光差異凝膠電泳技術分離蛋白質，Typhoon9410掃描獲取電泳圖譜，DecyderTM2D6.5軟件尋找差異蛋白質點，將凝膠進行Deeppurple染色，然后用Ettan Spot Picker將差異蛋白質點從凝膠中切下，胰酶酶解，應用液相色譜-質譜聯(lián)用技術(LC-MS)對差異蛋白質點進行分析，將生成的質譜數(shù)據用Bio Wo

6、rks3.3.1數(shù)據分析軟件中的SEQUEST算法進行計算，在NCBI中搜索數(shù)據庫，鑒定蛋白質。
　　結果:
　　1預試驗結果
　　預試驗應用甲醇/NH4HCO3沉淀法、苯酚抽提法提取唾液蛋白，用DIGEbuffer復溶后均有粘稠透明膠狀物出現(xiàn)，且甲醇/NH4HCO3沉淀法提取蛋白后蛋白有明顯的丟失現(xiàn)象，將膠狀物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后出現(xiàn)蛋白條帶，說明唾液蛋白復溶時并沒有完全溶解到DIGEbuffer

7、中，為了增加唾液蛋白的溶解度，將苯酚抽提蛋白復溶后經超聲處理50s，測定蛋白濃度，盡管蛋白濃度有所上升，但仍有膠狀物存在，唾液蛋白并沒有完全溶解。而經2-D Clean-Up Kit提取蛋白，DIGE buffer復溶蛋白后，沒有發(fā)現(xiàn)膠狀物的存在，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示各樣品條帶清晰，無明顯蛋白質丟失、降解。2-D Clean-UpKit適合唾液蛋白質的提取。
　　2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

8、>　　口腔扁平苔蘚患者組和正常人組用2-D Clean-Up Kit提取唾液蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示蛋白條帶清晰，沒有明顯蛋白丟失和降解。
　　3雙向熒光差異凝膠電泳結果
　　雙向熒光差異凝膠電泳分離蛋白質后，圖像重復性較好、分辨率較高，蛋白質等電點和分子量分布范圍較廣。DecyderTM2D6.5軟件分析扁平苔蘚患者組和正常人組唾液差異蛋白質點數(shù)平均為317±71個，并用液相色譜-質譜技術鑒定了重復