顱內(nèi)動脈瘤患者血清雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)建立及患者血清蛋白組的變化和意義.pdf

1、研究背景 顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是腦動脈系統(tǒng)有破裂傾向的局限性病理擴(kuò)張，動脈瘤破裂引起的蛛網(wǎng)膜下腔出血占全部自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的70％-80％，是神經(jīng)外科的危重急癥之一，患者死亡率、致殘率極高，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康，同時給家庭和社會也帶來了沉重負(fù)擔(dān)。如果在IA破裂前，能及時明確診斷并給予神經(jīng)介入栓塞或顯微外科手術(shù)等恰當(dāng)?shù)闹委?，患者預(yù)后可以大大改善。但是由于IA的具體病因、發(fā)病機(jī)制

2、不清，尚未有有效的生化指標(biāo)可以預(yù)測IA的存在，因此目前IA的診斷和篩選主要依靠腦血管造影(DSA)、磁共振血管造影(MRA)和CT血管造影(CTA)。三種診斷方法均費(fèi)用高昂，難以進(jìn)行大規(guī)模篩查，同時，作為金標(biāo)準(zhǔn)的DSA是有創(chuàng)檢查，更難于被檢查對象所接受。對IA患者血清進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，尋找患者血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并與以往對IA的基因研究資料相結(jié)合，不僅有助于從分子水平認(rèn)識IA的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，也可以為IA的篩選和診斷提供有效的分子標(biāo)記

3、物，并有望為IA的防治提供新的分子靶點(diǎn)。 應(yīng)用蛋白組學(xué)方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多蛋白的表達(dá)差異與特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，例如克一雅氏病可能與載脂蛋白E的表達(dá)差異有關(guān)，β-2微球蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能與老年癡呆有關(guān)。但是，傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)靈敏度較低，難以檢測低豐度蛋白質(zhì)，同時由于每塊膠只能分離一個樣本，因而受人為操作的影響，膠間的差異較大，實(shí)驗(yàn)室間可重復(fù)性也較差。 雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳(Two-dimen

4、tional difference in-gel electrophoresis，Z-DDIGE)是近年來發(fā)展起來了一項新型電泳技術(shù)，該技術(shù)使用了一組特殊的CyDyeDIGE熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)，對低豐度蛋白的探測靈敏度大幅度提高，同時由于內(nèi)標(biāo)的建立，大大減少了人為因素影響，可信度大幅提高。因而，該技術(shù)正受到越來越多蛋白組學(xué)研究者的歡迎。顱內(nèi)動脈瘤患者血清2-D DIGE技術(shù)尚未建立，應(yīng)用該技術(shù)尋找顱內(nèi)動脈瘤患者血清中表達(dá)

5、差異蛋白質(zhì)的研究，目前國內(nèi)外均未見報道。 研究目的 1．建立顱內(nèi)動脈瘤患者血清雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，為下一步利用該技術(shù)研究顱內(nèi)動脈瘤患者血清蛋白組變化奠定基礎(chǔ)。 2．尋找顱內(nèi)動脈瘤患者血清中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，探討這些蛋白在顱內(nèi)動脈瘤 發(fā)生發(fā)展中的作用，為顱內(nèi)動脈瘤的早期診斷和篩選提供潛在的分子標(biāo)記物。 3．應(yīng)用Western blot技術(shù)驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定結(jié)果的真實(shí)性、可靠性。 研究方法

6、 1．收集顱內(nèi)動脈瘤、腦挫裂傷患者和正常成人血清樣本各4例，血清經(jīng)PROT-BA Kit試劑盒處理后，分別進(jìn)行不同的CyDye染料交叉標(biāo)記，然后依次進(jìn)行雙 向膠內(nèi)差異凝膠電泳、圖像掃描并用專用分析軟件DeCyder v6.0比較各組樣本間蛋白點(diǎn)圖像差異，并評估該技術(shù)體系。 2．提取顱內(nèi)動脈瘤患者、腦挫裂傷患者及正常成人血清蛋白，用不同的CyDye 染料交叉標(biāo)記后依次進(jìn)行雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳以分離蛋白質(zhì)、圖像分析以 尋找

7、表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，對表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖譜，檢索MASCOT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。 3．收集顱內(nèi)動脈瘤20例、腦挫裂傷伴蛛網(wǎng)膜下腔出血患者22例和正常成人血清樣本21例，提取血清總蛋白，行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)印至醋酸 纖維素膜，與小鼠抗人結(jié)合珠蛋白多克隆抗體、山羊抗人間-α-胰蛋白酶抑制 因子重鏈相關(guān)蛋白多克隆抗體、兔抗人α1-抗糜蛋白酶單克隆抗體以及兔抗 人載脂蛋

8、白J多克隆抗體一抗、相應(yīng)二抗共孵，放入超敏發(fā)光液充分浸泡后,置入凝膠成像系統(tǒng)曝光、圖像掃描，GnenTool軟件測得蛋白條帶吸光度值,行各組間匕述蛋白表達(dá)量的比較。 研究結(jié)果 1．經(jīng)過雙向差異電泳，在所有pH3-10的梯度膠條上均得到了蛋白質(zhì)表達(dá)譜，經(jīng)軟件處理，不同染料標(biāo)記的樣本呈現(xiàn)不同顏色的圖譜，在每塊膠上均可發(fā)現(xiàn) 數(shù)以千計的蛋白質(zhì)點(diǎn)。使用：DeCyder軟件分析發(fā)現(xiàn)，腦動脈瘤患者與正常成人血清中差異點(diǎn)21個，腦挫裂

9、傷患者與正常成人血清中差異點(diǎn)19個，腦動 脈瘤患者與腦挫裂傷患者差異點(diǎn)10個，各組間差異點(diǎn)有部分交叉，共有38 個點(diǎn)差異表達(dá)1.5倍以上。 2．經(jīng)圖像分析發(fā)現(xiàn)，有11個蛋白點(diǎn)僅在顱內(nèi)動脈瘤患者與正常成人間存在有統(tǒng) 計學(xué)意義的表達(dá)差異，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，其中的7個蛋白點(diǎn)得以確認(rèn)為5種已知 蛋白質(zhì)，分別為：結(jié)合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2糖蛋白、載脂蛋白J(凝聚素)及間-α-胰蛋白酶抑制因子重鏈相關(guān)蛋白。這些蛋白在顱

10、內(nèi)動脈瘤患者血清中均表達(dá)升高1.5倍以上。 3．經(jīng)凝膠分析儀處理，各實(shí)驗(yàn)組均可觀察到相應(yīng)特異性蛋白條帶。證明質(zhì)譜鑒定結(jié)果無誤。圖像及吸光度統(tǒng)計分析均顯示，上述蛋白在顱內(nèi)動脈瘤患者血 清中表達(dá)量升高，在腦挫裂傷患者血清中沒有表達(dá)差異。 結(jié)論 1．成功建立了顱內(nèi)動脈瘤患者血清雙向膠內(nèi)差異電泳技術(shù)體系，為研究顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供了一種有效手段。 2．結(jié)合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2 糖蛋