應(yīng)用siRNA特異沉默EBV潛伏期基因EBNA2表達(dá)的初步研究.pdf

1、EBNA2是EBV感染宿主細(xì)胞后最先表達(dá)的病毒基因產(chǎn)物之一，由BYRF1基因編碼，與細(xì)胞內(nèi)蛋白無(wú)任何明顯的同源序列。EBNA2是一種病毒轉(zhuǎn)錄因子，不能直接與DNA結(jié)合，但可通過(guò)與細(xì)胞抑制重組信號(hào)結(jié)合蛋白R(shí)BP-J k及其它一些胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合間接作用于EBNA2反應(yīng)啟動(dòng)子。EBNA2具有核定位序列、DNA結(jié)合部位及轉(zhuǎn)錄激活部位等功能區(qū)域，是首個(gè)被確定與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有密切關(guān)系的病毒蛋白。EBNA2缺失的EBV毒株P(guān)3-HR1失

2、去轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的能力，提示我們可以通過(guò)干擾EBNA2的表達(dá)影響其轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力。同時(shí)作為EBV BYRF1基因特異性表達(dá)的產(chǎn)物，EBNA2可以反映EBV的存在情況以及在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)。 RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的遺傳干擾現(xiàn)象，能夠特異、有效地降解mRNA，引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默；研究表明，21-23nt的小干擾RNA(small interferenceRNA，siRNA)可介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特定基因的沉默。RNAi具有高效性和

3、高度特異性，可能成為封閉基因的新技術(shù)而在基因功能研究和疾病基因治療中發(fā)揮重要作用。大量研究結(jié)果證實(shí)，siRNA可以有效抑制所有內(nèi)源性基因的mRNA從而敲除該基因的功能，目前siRNA己經(jīng)成為敲除特定基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的強(qiáng)大工具。 本研究中我們化學(xué)合成了靶向EBNA2編碼基因的特異性siRNA，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染EBVⅢ型潛伏的胃癌上皮細(xì)胞GT38，觀察分析siRNA對(duì)EBNA2基因表達(dá)的抑制作用以及靶基因沉默對(duì)GT38細(xì)胞

4、的影響。同時(shí)構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBNA2編碼基因的siRNA的psuPER逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，進(jìn)而篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞克隆，以觀察比較兩種干涉方式對(duì)目的基因表達(dá)的抑制效果以及對(duì)靶細(xì)胞的影響。 第一部分化學(xué)合成siRNA對(duì)GT38細(xì)胞EBNA2基因表達(dá)的抑制作用目的采用化學(xué)合成法合成針對(duì)EBNA2編碼基因的siRNA，分別轉(zhuǎn)染EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞GT38細(xì)胞，觀察人工合成siRNA對(duì)EBNA2的特異沉默效果以及EBNA2特異性沉默對(duì)EB

5、V陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的影響。 方法 ①化學(xué)合成3組靶向EBNA2編碼基因的siRNA，以EBVⅢ型潛伏的胃癌上皮細(xì)胞GT38為靶細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法分別將3組siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，同時(shí)設(shè)脂質(zhì)體對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。②采用RT-PCR檢測(cè)靶基因EBNA2 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并篩選出最佳轉(zhuǎn)染濃度及抑制效果最為理想的siRNA鏈。③將抑制效果最好的siRNA鏈以最佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，采用Hoechst 33258、透射電鏡和流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) GT38細(xì)胞周期和凋亡的變化。 結(jié)果 ①RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞對(duì)照相比，siRNA789、siRNA764和siRNA257對(duì)GT38細(xì)胞EBNA2的表達(dá)均具有明顯的抑制作用(P<0.01)，其中以siRNA789的抑制作用更強(qiáng)；②與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染sirNA789后48h和72h GT38細(xì)胞中EBNA2 mRNA表達(dá)水平明顯下降，兩兩間比較均有顯著性差異(P<0.0

7、1)，而siRNA789轉(zhuǎn)染后24h抑制效果不明顯(P>0.05)；③在0～50nM濃度范圍內(nèi)siRNA789轉(zhuǎn)染72h后EBNA2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平隨濃度增加而逐漸降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)siRNA作用濃度為50nM～100nM siRNA各組間差別不明顯(P>0.05)，轉(zhuǎn)染非特異siRNA細(xì)胞組與細(xì)胞對(duì)照比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；④Hoechst 33258染色和透射電鏡結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)

8、組GT38細(xì)胞未見(jiàn)胞核濃縮，也未觀察到凋亡小體；流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞未出現(xiàn)凋亡，但其S其細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 結(jié)論 化學(xué)合成siRNA能有效抑制GT38細(xì)胞中EBNA2編碼基因的表達(dá)，其抑制作用具有時(shí)間依賴性，在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，且對(duì)靶基因的特定序列具有較強(qiáng)的選擇偏向性?；瘜W(xué)合成siRNA誘導(dǎo)EBNA2編碼基因沉默后，不能引起靶細(xì)胞明顯的凋亡，但可引起靶細(xì)胞S期數(shù)量減少。 第

9、二部分特異性沉默BV潛伏期基因EBNA2 pSIJPER retro RNAi系統(tǒng)的構(gòu)建 目的:構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBV核抗原EBNA2編碼基因siRNA的pSUPER逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細(xì)胞克隆。 方法:采用DNA重組技術(shù)將60nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBNA2小發(fā)夾RNA(smallhairpin RNA，shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER.retro.neogfp，并用限制性內(nèi)切

10、酶酶切鑒定以及測(cè)序鑒定；脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系PA317，G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞克隆。 結(jié)果:酶切鑒定及測(cè)序鑒定結(jié)果表明插入片段的序列和方向完全正確；重組載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后可表達(dá)綠色熒光蛋白，經(jīng)G4-18篩選獲得可穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗性細(xì)胞克?。徊《镜味葹?.5×10<'5>CFU/ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建了能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBV核抗原EBNA2編碼基因siRNA的pSUPER逆轉(zhuǎn)錄病