胰高血糖素、瘦蛋白對(duì)牛肝細(xì)胞PEPCKmRNA表達(dá)的影響.pdf

1、本研究利用體外培養(yǎng)的新生牛單層肝細(xì)胞，采用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同濃度胰高血糖素、瘦蛋白對(duì)肝糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)mRNA表達(dá)的影響。首先，根據(jù)GenBank上發(fā)表的牛PEPCK序列，設(shè)計(jì)一對(duì)外圍引物、一對(duì)內(nèi)圍引物、一個(gè)MGb熒光探針；然后應(yīng)用外圍引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，成功擴(kuò)增出PEPCK目的片段，大小為337bp，并將其克隆到pMD-18

2、T載體上測(cè)序。其測(cè)序結(jié)果與GenBank上的序列進(jìn)行同源性比較，與發(fā)表的基因序列同源性為99％，只有一個(gè)堿基發(fā)生突變，且該突變未發(fā)生在探針?lè)秶鷥?nèi)，表明基因克隆結(jié)果正確可用于陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。隨后利用該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，成功建立了檢測(cè)該基因的方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該方法靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可以用于檢測(cè)PEPCK基因的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)的酶消化法和機(jī)械碾磨法成功地進(jìn)行

3、了新生牛體外肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)。通過(guò)在原代培養(yǎng)的新生牛肝細(xì)胞中分別添加不同濃度的胰高血糖素、瘦蛋白檢測(cè)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA的變動(dòng)規(guī)律。培養(yǎng)液中胰高血糖素濃度分別為(0、1、10、100和1000nmol/L)，瘦蛋白濃度分別為(0、2.5、5.0、10和50ng/mL)；培養(yǎng)12h后，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，通過(guò)已經(jīng)建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)肝細(xì)胞PEPCKmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：隨著胰高血糖素濃度的