應(yīng)用于白血病免疫分型芯片的外周血白細胞分離方法的研究.pdf

1、目的： 從全血中分離和純化白細胞是許多生物學和醫(yī)學應(yīng)用中的基本方法，它廣泛被應(yīng)用于包括骨髓移植患者巨細胞病毒感染的早期診斷和白血病的免疫分型的診斷等許多方面。眾所周知，白細胞分離是許多生物學實驗的第一步，也是至關(guān)重要的一步，因為后續(xù)的研究成果的可信度很大程度上取決于分離的白細胞活性與純度。因此對白細胞分離方法的研究成為當血液學一個頗為熱點的研究課題。 目前國內(nèi)外報道的分離白細胞的方法很多，包括密度梯度離心法、物理吸附法、

2、細胞電泳法、免疫磁珠法、流式細胞法等，其中有的分離方法所提取的細胞純度和細胞濃度已經(jīng)可以達到很高的標準。但這些方法只適用于單種白細胞或單個白細胞亞群的分離，而本實驗研究的主要目的是為了尋找一種適用于白血病免疫分型芯片的細胞分離方法，它的最終結(jié)果是要將外周血中的全白細胞分離提取出來。 為了分離、提取形態(tài)及功能完整的全白細胞，本實驗在既往細胞分離方法的基礎(chǔ)上作了改進，根據(jù)等密度梯度離心原理，通過改變細胞分離液比重及滲透壓自制了一種全

3、白細胞分離液，經(jīng)過我們反復對全白細胞分離液條件探索以期達到一次性分離全白細胞的目的。 方法: 1、全白細胞分離液的配制右旋糖苷(或聚蔗糖)和泛影葡胺按不同比例混合配制成1.108g/ml、1.110g/ml、1.112g/ml、1.113g/ml四種比重分離液，并且在不同比重的分離液中分別加入五種不同濃度的氯化鈉來調(diào)節(jié)分離液滲透壓。 2、全白細胞分離液最佳比重及最佳滲透壓探索取50例正常外周血標本，采用四種比重五

4、種滲透壓全白細胞分離液，比較分離效果，篩選分離液的最佳滲透壓和最佳比重。細胞分離效果測定參數(shù)為自細胞回收率、紅細胞去除率和各種白細胞比例三方面。 3、兩種全白細胞分離液比較取20例正常外周血標本，通過我們配制的兩種全白細胞分離液(Dextran-全白細胞分離液和Ficoll-全白細胞分離液)對白細胞分離效果進行比較，篩選最佳全白細胞分離液。細胞分離效果比較參數(shù)為細胞濃度，細胞純度，細胞活性。 4、全白細胞分離液適用的芯片

5、上固定抗體濃度確定將原始濃度為0.2mg/ml的單克隆抗體按比例1∶2；1∶4；1∶8；1∶16稀釋，用MicroGrid Ⅱ芯片點樣儀將其點在氨基硅烷-醛基修飾的玻片上，制備單克隆微陣列；然后用全白細胞分離液分離提取白細胞，制備白細胞懸液；經(jīng)過吖叮橙染色后孵育芯片；通過掃描儀掃描及顯微鏡觀察結(jié)果比較篩選芯片上固定抗體濃度。 5、全白細胞分離液對正常血細胞的分離及芯片對細胞分離結(jié)果的檢測取臨床50例正常外周血標本，首先用全白細胞

6、分離液進行白細胞分離，芯片孵育及細胞染色，然后通過對顯微鏡下各抗體點捕獲細胞形態(tài)觀察和數(shù)量統(tǒng)計，檢測全白細胞分離液分離白細胞效果。 6、全白細胞分離液對白血病細胞的分離及其在白血病免疫分型芯片的應(yīng)用通過全白細胞分離液對10例白血病標本的分離及芯片對白血病細胞捕獲，檢測全白細胞分離液對腫瘤細胞分離效果。 結(jié)論: 本實驗自制的全白細胞分離液成功地分離全白細胞。所獲得的細胞濃度及細胞純度高，細胞形態(tài)及細胞活性保持良好，