應(yīng)用SNP芯片分析肝細(xì)胞癌染色體4q的雜合性缺失及ING2基因在肝癌中表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景： 原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，九十年代以來已成為我國第二位的癌癥殺手，而且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。肝癌的組織學(xué)來源比較單一，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcmoma，HCC)是最常見的組織學(xué)類型。HCC具有起病隱匿，侵襲性生長快速，惡性程度高，治療后易復(fù)發(fā)，病死率高等特點(diǎn)，盡管治療手段發(fā)展迅速，但肝癌五年生存率仍較低。加強(qiáng)肝癌病因?qū)W的研究成為人類目前與肝癌抗?fàn)幍年P(guān)鍵。肝癌相關(guān)基因的深入研究

2、，對于闡明肝癌的發(fā)病機(jī)理，肝癌的早期診斷及開發(fā)出新的治療手段，進(jìn)而提高肝癌患者的生存率都具有重要的意義。 HCC的發(fā)生過程是多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程。HCC的癌前病變中分子遺傳學(xué)的改變主要包括腫瘤抑癌基因失活，癌基因的激活，其中抑癌基因失活在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。抑癌基因失活的主要方式是缺失、突變和異常甲基化，在惡性腫瘤中等位基因雜合性缺失(Loss of Heterozygosity，LOH)的位點(diǎn)很可

3、能就是抑癌基因的潛在區(qū)域，分析雜合性缺失已經(jīng)成為目前檢測腫瘤抑制基因失活和發(fā)現(xiàn)及定位新的腫瘤抑制基因的重要手段之一，而作為雜合性缺失分析的遺傳標(biāo)記也在不斷的更新?lián)Q代，分別經(jīng)歷了RFLP、 MS及最近的SNP。SNP在基因組中分布廣泛，密度高，遺傳穩(wěn)定性好、具有代表性等特性，從而成為LOH檢測的新的標(biāo)記。因?yàn)槭菃蝹€堿基的突變，非此即彼，與電腦二進(jìn)制的程序相同，可以直接利用芯片技術(shù)高通量、快速的分析結(jié)果，SNP芯片技術(shù)已經(jīng)在與人類疾病相關(guān)基

4、因的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。利用SNP芯片技術(shù)檢測腫瘤染色體的LOH，成為了尋找腫瘤相關(guān)抑癌基因的主要手段之一。國內(nèi)外已有許多對HCC全基因組掃描或者染色體分析的研究，其中染色體4q在HCC中經(jīng)常發(fā)生缺失，而在其它腫瘤中相對比較少見。前期研究中我們用382個微衛(wèi)星標(biāo)志對65例的人肝細(xì)胞癌進(jìn)行了全基因組范圍等位基因LOH的分析，發(fā)現(xiàn)4q雜合性缺失的頻率高達(dá)48.1％，提示4q上存在肝癌相關(guān)的抑癌基因。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新

5、性的應(yīng)用我們自己開發(fā)的SNP芯片技術(shù)針對整條4q進(jìn)行掃描，以期篩查出肝癌相關(guān)的抑癌基因。 第一部分　SNP芯片技術(shù)分析肝細(xì)胞癌染色體4q雜合性缺失的初步研究　　目的：在前期研究的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性的應(yīng)用我們自己開發(fā)的SNP芯片技術(shù)針對染色體4q進(jìn)行掃描，分析SNP的雜合性缺失，并且探討4q上LOH的SNP位點(diǎn)與肝癌臨床病理參數(shù)，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)系。 方法：選取了4q上40個具有代表性的SNP位點(diǎn)制成SNP芯片，利用SNP芯片

6、技術(shù)對69例肝癌組織、5株肝癌細(xì)胞系及1株changliver進(jìn)行LOH的分析，并且探討LOH的SNP位點(diǎn)與肝癌臨床病理參數(shù)，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)系。 結(jié)果：69例肝癌中至少有1個位點(diǎn)出現(xiàn)雜合性缺失者51例，染色體4q的總雜合性缺失頻率為73.9％，LOH發(fā)生頻率最高的位點(diǎn)為rs2249916(47.0％)，位于4q35.2；其次為rs10013652(45.4％)，位于4q26。LOH＞30％的位點(diǎn)有9個(rs2298732、rs9

7、65012、rs10013652、rs1567475、rs1514479、rs2249916、rs7677254、rs10033674及rs1876442)。LOH發(fā)生頻率較高的兩個區(qū)域?yàn)?q24-26及4q34.3-35。rs1567475(4q34.3)位點(diǎn)的LOH與肝癌的病理分級相關(guān)(p＜0.05)，病理分化較差的肝癌表現(xiàn)出高頻的LOH；rs7656234位點(diǎn)(4q13.3)與HBV感染相關(guān)(p＜0.05)；其余的SNP位點(diǎn)與年齡

8、、性別、HBV感染、血清AFP、腫瘤大小、肝硬化及病理分級均無關(guān)(p＞0.05)?！　〗Y(jié)論：利用SNP芯片技術(shù)對4q上的40個SNP位點(diǎn)進(jìn)行LOH分析，發(fā)現(xiàn)4q上存在兩個高頻缺失的區(qū)域(4q24-26及4q34.3-4q35)，而且rs1567475(4q34.3)位點(diǎn)的LOH與肝癌的病理分級相關(guān)，病理分化較差的肝癌表現(xiàn)出高頻的LOH，提示在這兩個區(qū)域可能存在與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的抑癌基因。 第二部分　SNP芯片技術(shù)分析肝細(xì)胞癌

9、染色體4q34.3-35區(qū)域基因的雜合性缺失　　目的：在第一部分研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SNP芯片技術(shù)檢測高頻缺失的4q34.3-4q35區(qū)域內(nèi)的63個基因的雜合性缺失頻率，篩選出缺失頻率較高的基因。并且探討高頻缺失SNP位點(diǎn)與肝癌臨床病理參數(shù)，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)系。 方法：選取4q34.3-4q35內(nèi)63個基因內(nèi)部的338個具有代表性的SNP位點(diǎn)制成SNP芯片，利用SNP芯片技術(shù)對69例肝癌組織、5株肝癌細(xì)胞系及1株changlive

10、r進(jìn)行LOH的分析，并且探討LOH的SNP位點(diǎn)與肝癌臨床病理參數(shù)，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)系。 結(jié)果：肝癌中4q34-35.2區(qū)域的雜合性缺失頻率為94.2％。LOH發(fā)生頻率最高的位點(diǎn)為rs2048076(46.7％)，位于NEIL3基因內(nèi)部，其次為rs6830958(41.2％)，位于ING2基因內(nèi)部，另一個LOH頻率不小于40％為rs10000856，在IRF2基因內(nèi)部。LOH＞20％的位點(diǎn)有19個。其余SNP位點(diǎn)的LOH均小于20％

11、，或者無雜合性缺失。在肝癌細(xì)胞系中，SNP的LOH均與changliver相比，結(jié)果顯示ING2基因內(nèi)部的rs6830958位點(diǎn)在兩個肝癌細(xì)胞系中發(fā)生缺失，包括HepG2及SK-HEP-1，另外發(fā)現(xiàn)基因IRF2內(nèi)部的rs10000856位點(diǎn)在HepG2與BEL7402細(xì)胞系中發(fā)生LOH。在所檢測的高頻LOH(＞20％)的SNP位點(diǎn)中，雜合性缺失與年齡、性別、HBV感染、血清AFP、腫瘤大小、肝硬化及病理分級均無關(guān)(p＞0.05)。　　

12、結(jié)論：對肝癌中高頻雜合性缺失的4q34.3-4q35.2區(qū)域的63個基因設(shè)計(jì)了338個SNP位點(diǎn)，利用芯片技術(shù)檢測基因的LOH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEIL3(rs2048076)、ING2(rs6830958)及IRF2(rs2048076)有較高頻率的LOH(≥40％)。ING2(rs6830958)及IRF2(rs2048076)在肝癌細(xì)胞系有較易發(fā)生LOH?！　〉谌糠諭NG2基因在肝細(xì)胞癌中表達(dá)及臨床意義的研究　　在第一、二部分的研究

13、中發(fā)現(xiàn)肝癌高頻缺失區(qū)域4q34.3-4q35中的ING2基因內(nèi)部的rs6830958為高頻缺失位點(diǎn)。ING2基因作為生長抑制因子家族的主要成員，被認(rèn)為是一個新的候選抑癌基因可以抑制細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)凋亡及參與DNA修復(fù)，研究表明ING2與P53協(xié)同作用，發(fā)揮抑癌功能。 目的：本研究旨在探討ING2基因在肝癌中的表達(dá)，并且分析其表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系。 方法：收集了87例肝癌及正常對照組織，應(yīng)用RT-PCR、western

14、 blot技術(shù)檢測了ING2基因的表達(dá)水平；免疫組化技術(shù)檢測了84例石蠟包埋組織ING2在肝癌中的表達(dá)水平，分析了它與臨床參數(shù)的關(guān)系并且探討與肝癌預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果：ING2在mRNA及蛋白水平相對與對照組織表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。免疫組化技術(shù)檢測了84例肝癌組織的ING2表達(dá)水平，其中44例ING2低表達(dá)(52.4％．)，而且ING2的表達(dá)與腫瘤大小，分化程度及AFP密切相關(guān)(p＜0.05)。生存分析顯示ING