口蹄疫病毒Asial型P12A3C基因自殺式真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirusFMDV)主要引起牛、豬、羊等偶蹄動物的口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)。FMD是一種急性接觸性傳染病，發(fā)病率極高，并能形成大范圍流行。疫苗免疫是目前以至將來防控口蹄疫的主要策略之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及對口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的深入了解，核酸疫苗，尤其是最近出現(xiàn)的自殺式核酸疫苗已成為口蹄疫新型分子疫苗研發(fā)的主要方向。 首先從As

2、iaI口蹄疫病毒中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用特異性的引物擴(kuò)增獲得目的基因P12A、3C，將其分別與pMD18-T載體連接，構(gòu)建成重組克隆載體pMD-P12A、pMD-3C；再將pMD-P12A用EcoRI，XhoI酶切，回收P12A片斷；再將pMD-3C用EcoRI，XhoI酶切回收；兩者連接，轉(zhuǎn)化JM109后獲得重組質(zhì)粒pMD-P12A3C；將此重組質(zhì)粒用BamH、SmaI酶切回收P12A3C；自殺式真核表達(dá)載體psh

3、ame2α用BamH、SmaI酶切回收；兩者連接，轉(zhuǎn)化JM109后獲得重組自殺式真核表達(dá)質(zhì)粒pshame2α-P12A3C，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定，證明P12A3C片斷以正確的方向插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建了自殺式真核表達(dá)載體pshame2α-P12A3C。經(jīng)間接熒光抗體檢測和EIISA檢測，此表達(dá)載體可在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)出目的蛋白。 本試驗(yàn)將口蹄疫病毒P12A基因和3C基因同時插入含有甲病毒啟動