CD40LsiRNA阻斷CD40-CD40L受體配體軸抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究.pdf

1、CD40LsiRNA阻斷CD40/CD40L受體配體軸抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究CD40與CD40L結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)大量細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等物質(zhì)的表達(dá)促進(jìn)AS相關(guān)的炎癥、免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)粥樣斑塊發(fā)生、進(jìn)展，增加斑塊的易損性。RNAi是一種新興的基因沉默技術(shù)，具有高特異性、高效性、簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)。首先在體外實(shí)驗(yàn)中篩選出RNAi的有效作用靶點(diǎn)。在篩選出有效靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)構(gòu)建CD40LsiRNA慢病毒

2、載體。 建立大鼠AS模型：高脂飲食+導(dǎo)絲損傷頸動(dòng)脈內(nèi)膜。處理后4周，血管腔內(nèi)注入慢病毒，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)3周后取材。結(jié)果表明，構(gòu)建的慢病毒載體可有效降解CD40LsiRNA，抑制大鼠對(duì)CD40L的表達(dá)，并進(jìn)一步減少TF和MMP-9的合成，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并限制其進(jìn)展進(jìn)展，為安全、有效預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥開(kāi)辟了新的途徑。 研究背景、目的近年來(lái)CD40和CD40L對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和斑塊穩(wěn)定性的影響日益引起

3、人們的重視。CD40與CD40L均為跨膜蛋白，最初分別發(fā)現(xiàn)于B淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞表面，是CD4+T介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞增殖、分化，以及抗體產(chǎn)生、類型轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)成分。此后的研究證實(shí)，CD40與CD40L在AS病變的主要相關(guān)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞)中均有表達(dá)。CD40與CD40L結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)大量細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等物質(zhì)的表達(dá)促進(jìn)AS相關(guān)的炎癥、免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)粥樣斑塊發(fā)生

4、、進(jìn)展，增加斑塊的易損性。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組及穩(wěn)定性心絞痛組相比，不穩(wěn)定性心絞痛和急性心?；颊哐錽CD40L水平顯著升高。病理研究進(jìn)一步證實(shí)，粥樣硬化斑塊局部，尤其在斑塊易破裂的肩部CD40和CD40L的表達(dá)明顯增多；另外，體內(nèi)sCD40L與血小板活化程度及促凝狀態(tài)呈正相關(guān)，CD40/CD40L受體配體軸可以促進(jìn)血栓的形成。 體內(nèi)外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分血管緊張素受體拮抗劑、他汀類藥物與GPⅡb/Ⅲa拮抗劑可減少CD40或CD

5、40L的表達(dá)，阻斷CD40/CD40L受體配體軸，其降壓、調(diào)脂、抑制血小板以外的抗AS作用很可能就來(lái)源于此。大量事實(shí)表明，阻斷該受體/配體軸有可能成為減少粥樣硬化斑塊形成，預(yù)防斑塊不穩(wěn)定與破裂的有效治療途徑。 以往，國(guó)內(nèi)外研究者曾運(yùn)用單克隆抗體、重組腺病毒載體等方法抑制CD40/CD40L的作用，但因免疫源性、生物毒性、操作復(fù)雜等原因未能推廣應(yīng)用。 RNAi是一種新興的基因沉默技術(shù)，具有高特異性、高效性、簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)，

6、為安全、有效地阻斷CD40/CD40L受體/配體軸提供了新的希望。 方法1.本研究根據(jù)已知的大鼠CD40LmRNA序列和通用的siRNA設(shè)計(jì)原則，通過(guò)化學(xué)合成針對(duì)CD40LmRNA三個(gè)靶點(diǎn)的siRNA，構(gòu)建CD40L-GFP(熒光蛋白)重組質(zhì)粒載體，在體外實(shí)驗(yàn)中共轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，根據(jù)熒光強(qiáng)度(即GFP表達(dá)量)判斷抑制作用的優(yōu)劣(干擾作用強(qiáng)的序列同時(shí)減少熒光蛋白的表達(dá)量)，從而篩選出干擾效果最佳的mRNA靶點(diǎn)：針對(duì)746靶點(diǎn)5

7、'GAATTGGCTTCTCATCTAT3'。 2.在篩選出有效靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)構(gòu)建CD40LsiRNA慢病毒載體，主要步驟：PCR合擴(kuò)增雙鏈DNA、線性化后擴(kuò)增、測(cè)序鑒定、病毒包裝、測(cè)定病毒滴度。 3.在構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體的同時(shí)建立Wistar大鼠AS模型：高脂飲食喂養(yǎng)2周后測(cè)血TC、LDL-c濃度，證實(shí)形成高脂血癥后以導(dǎo)絲損傷頸動(dòng)脈內(nèi)膜，持續(xù)高脂喂養(yǎng)。手術(shù)處理后4周血管腔內(nèi)注入慢病毒：結(jié)扎曾損傷的血管，

8、病毒作用15分鐘左右，以0B膠修復(fù)血管，松開(kāi)血管夾。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)3周后取材。通過(guò)觀察冰凍切片的熒光強(qiáng)度判斷慢病毒的轉(zhuǎn)染效率(載體上連有GFP)；采用血清學(xué)、免疫組織化學(xué)、及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法，從基因、蛋白和組織水平證實(shí)了CD40LsiRNA慢病毒載體抑制CD40L基因表達(dá)的作用；另外，測(cè)定血清TF水平，用免疫組織化學(xué)的方法顯示頸動(dòng)脈局部基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)量。 結(jié)果篩選出RNAi有效靶點(diǎn)后，成功構(gòu)建了表達(dá)大鼠CD4

9、0LsiRNA的慢病毒載體，建立了Wistar大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。頸動(dòng)脈冰凍切片顯示，綠色熒光強(qiáng)度明顯，均勻分布于內(nèi)膜和中膜。與模型組及非特異siRNA慢病毒對(duì)照組相比，siRNA組CD40LmRNA和可溶性蛋白水平顯著降低，血管局部CD40L免疫組織化學(xué)染色明顯變淺；血清TF濃度以及斑塊局部基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)量顯著減少。 結(jié)論我們的研究表明，構(gòu)建的慢病毒載體可有效降解CD40LsiRNA，抑制大鼠對(duì)CD40L的表達(dá)，并進(jìn)一