阻斷VWF-膠原和VWF-血小板相互作用的新型的VWF A3區(qū)單抗的研制及其功能研究.pdf

1、血栓性疾病正嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，而血栓形成機(jī)理和防治的研究是醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域重大課題之一。在血栓形成過(guò)程中血小板發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而vonWillebrand因子（VWF）在血栓（尤且是動(dòng)脈血栓）形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。VWF是由血小板、內(nèi)皮細(xì)胞合成的大分子量的具有粘附功能的糖蛋白，在血栓形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它既可與血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，又可以和膠原結(jié)合介導(dǎo)血小板粘附聚集于受損的血管內(nèi)皮下組

2、織，導(dǎo)致血栓形成。在此過(guò)程中膠原—VWF—GPⅠb間的相互作用是血小板活化的早期事件，VWF是血小板與血管壁膠原之間的橋梁分子，因此阻斷VWF在此過(guò)程中的作用，可以有效地抑制血栓形成。 本文根據(jù)膠原—VWF—GPⅠb軸相互作用的關(guān)系，針對(duì)GPⅠbα、VWF和膠原分子進(jìn)行三部分研究。（1）首先，將與VWF A1區(qū)結(jié)合的重組GPⅠbα活性片段H1—V289（rGPⅠb H1—V289）和與膠原結(jié)合的VWF—A3區(qū)基因片段分別在CHO

3、細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)及其生物學(xué)活性研究；（2）然后，用rVWF A3為抗原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)制備和鑒定了兩株VWF A3區(qū)單抗SZ—123和SZ—125；（3）最后，對(duì)SZ—123和S2—125抑制VWF—膠原和VWF—GPⅠbα相互作用和抑制血小板在Ⅲ型膠原上粘附功能作進(jìn)一步研究。試圖進(jìn)一步闡明VWFA1和A3區(qū)相互作用關(guān)系和VWF構(gòu)象和功能調(diào)節(jié)關(guān)系提供理論依據(jù)，同時(shí)期望獲得性能優(yōu)越的抗栓制劑，對(duì)預(yù)防和治療

4、血栓性疾病具有重要的意義。 一、重組糖蛋白Ibα活性片段H1—V289和VWF A3區(qū)的表達(dá)和功能研究 血小板上GPⅠbα是血栓形成過(guò)程中的的一個(gè)重要糖蛋白，在初期止血階段發(fā)揮著重要作用。GPIbα氨基末端分子量45KD片段（H1—V289）既是VWF A1區(qū)結(jié)合部位，又是凝血酶結(jié)合部位。因此建立表達(dá)重組糖蛋白Ibα活性片段（rGPⅠbαH1—V289）細(xì)胞株，對(duì)于研究GPⅠb—VWF—Collagen軸心中各成分之間相

5、互作用的機(jī)理和抗栓藥物的研究具有重大的理論和應(yīng)用價(jià)值。我們利用脂質(zhì)體將含有編碼GPⅠbα H1—V289 DNA質(zhì)粒pCMV3轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用SZ—2—溴化氰活化的—Sepharose4B親和層析法純化重組片段，用SDS—PAGE和Western—blot鑒定純化產(chǎn)品的純度和免疫學(xué)活性。用血小板聚集法檢測(cè)純化產(chǎn)品對(duì)瑞斯托霉素誘導(dǎo)血小板聚集功能的影響。用ELISA測(cè)定純化產(chǎn)品對(duì)VWF與血小板結(jié)合能力的影響。結(jié)果是每1L培養(yǎng)上清液可純化到

6、6.15mg rGPIbα H1—V289重組產(chǎn)品。SDS—PAGE顯示，純化的重組片段主要在42KD處顯一蛋白區(qū)帶，Western—blot顯示，抗GPⅠbα單抗SZ—2能與重組片段在42KD處顯單一蛋白區(qū)帶。純化重組片段能抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集功能。ELISA測(cè)定顯示純化產(chǎn)品抑制血漿VWF與血小板的結(jié)合能力。因此我們獲得的CHO細(xì)胞株能恒定表達(dá)rGPⅠbα H1—V289，重組片段具有較高的純度、免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性，有可

7、能開(kāi)發(fā)為有效的抗血栓藥物和進(jìn)行科學(xué)研究。 VWF—A3區(qū)是膠原的主要結(jié)合部位。我們應(yīng)用RT—PCR方法從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中克隆VWF—A3區(qū)基因片段。測(cè)序證明克隆的基因序列完全正確，然后構(gòu)建了表達(dá)載體pET—20b—VWF—A3，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，所表達(dá)的目的蛋白為菌體總蛋白的46.7%。經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖（Ni—NTA agarose）柱純化后，目的蛋白的純度在95%以上。大腸桿菌中高效表達(dá)的重組VWF—A3蛋白

8、（rVWF—A3）復(fù)性后，應(yīng)用膠原結(jié)合試驗(yàn)分析rVWF—A3蛋白的生物學(xué)活性。rVWF—A3與人胎盤(pán)和牛皮膚Ⅲ型膠原均有結(jié)合活性。結(jié)果表明rVWF—A3具有較高的純度和良好的生物學(xué)功能，可作為免疫原免疫Balb/C小鼠，制備抗VWF A3區(qū)的單抗。 二、VWF A3區(qū)特異性單抗SZ—123和SZ—125研制和鑒定 自從抗GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體7E3獲得FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于缺血性心臟患者的臨床治療、PTCA術(shù)后再梗塞的預(yù)防，

9、取得了滿(mǎn)意的療效，抗血栓抗體藥物的研制已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但在GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑的治療中，已報(bào)道若干副作用，包括出血、血小板減少等。因?yàn)閂WF在血小板和膠原之間起到橋梁作用，而VWF A3區(qū)與膠原的結(jié)合是啟動(dòng)血小板粘附、聚集并進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成的首要環(huán)節(jié)，因此針對(duì)VWF與膠原結(jié)合區(qū)域A3區(qū)的抗體有可能具有抑制血小板的粘附、聚集和抗血栓形成的作用。本研究用大腸桿菌表達(dá)的rVWF—A3蛋白免疫Balb/C小鼠，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)制

10、備單抗。用ELISA法鑒定單抗特異性，經(jīng)VWF膠原結(jié)合抑制試驗(yàn)篩選獲得抑制性單抗，用免疫印跡技術(shù)確定單抗與rVWF—A3和還原性人VWF識(shí)別的抗原分子。經(jīng)膠原結(jié)合試驗(yàn)確定單抗對(duì)VWF與膠原結(jié)合的影響。結(jié)果共獲得一組共30株抗VWF—A3區(qū)單抗，其中兩株確定為抑制VWF與膠原結(jié)合的單抗，分別命名為SZ—123和SZ—125，兩株單抗分別與rVWF—A3和VWF反應(yīng)強(qiáng)烈，而不與重組VWF—A1區(qū)、A2區(qū)反應(yīng)。Western—blot顯示SZ

11、—123和SZ—125分別識(shí)別分子量為27kDa的rVWF—A3區(qū)帶和還原性人VWF的250KDa的VWF單體和170KDa的VWF酶切片段。因此SZ—123和SZ—125是抗VWF—A3區(qū)特異性單抗。 三、VWF A3區(qū)單抗SZ—123和SZ—125的功能研究 為了研究單抗SZ—123和SZ125生物學(xué)功能，我們首先探討兩株VWF—A3區(qū)單抗，SZ—123和SZ—125對(duì)VWF—膠原相互作用的影響。通過(guò)用膠原結(jié)合試驗(yàn)測(cè)

12、定兩株單抗對(duì)VWF與人胎盤(pán)或牛皮膚Ⅲ型膠原結(jié)合反應(yīng)影響，同時(shí)測(cè)定了兩株單抗對(duì)正常人、彌猴、Beagle犬、兔、大鼠和豚鼠的血漿VWF與Ⅲ型膠原結(jié)合反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示單抗SZ—123和SZ—125劑量依賴(lài)性地抑制純化的人VWF與人的Ⅲ型膠原結(jié)合（IC50=0.07±0.02和0.15±0.03μg/ml）和與牛皮膚Ⅲ型膠原結(jié)合（IC50=0.48±0.06和0.51±0.07μg/ml）。單抗SZ—123和SZ—125也抑制正常人、彌猴

13、、Beagle犬血漿與Ⅲ型膠原結(jié)合反應(yīng)，但不抑制兔、大鼠和豚鼠的血漿VWF與Ⅲ型膠原結(jié)合反應(yīng)。因此單抗SZ—123和SZ—125是兩株中和性抗VWF—A3區(qū)單抗，能抑制VWF—膠原相互作用，是VWF依賴(lài)的血小板黏附于膠原的有潛能的抑制劑，可成為具有治療潛力的抗血栓藥物。 然后，我們探討SZ—123和SZ—125對(duì)VWF—GPⅠbα相互作用的影響。應(yīng)用瑞斯托霉素、博托酶素、牛血漿、膠原和ADP為誘導(dǎo)劑進(jìn)行血小板聚集試驗(yàn)。用ELIS

14、A測(cè)定了SZ—123和SZ—125對(duì)VWF與固相化的重組血小板GPIbα（H1—V298）活性片段或血小板結(jié)合的影響。血小板聚集試驗(yàn)顯示SZ—123和SZ—125分別抑制瑞斯托霉素、博托酶素、牛血漿誘導(dǎo)的血小板聚集，而不抑制膠原或ADP誘導(dǎo)的人血小板聚集。SZ—123和SZ—125也抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的VWF與固相化的重組血小板GPⅠbα活性片段（rGPⅠbα H1—V298）或血小板的結(jié)合。因此，單抗SZ—123和SZ—125不僅抑制

15、VWF—膠原的相互作用，而且阻斷VWF—血小板相互作用。另外，這兩株單抗也可以幫助我們說(shuō)明VWFA1和A3區(qū)之間的相互作用。我們認(rèn)為單抗SZ—123和SZ—125結(jié)合到VWF A3環(huán)，調(diào)節(jié)A1區(qū)的構(gòu)型和功能。 最后，我們探討了SZ—123和SZ—125在高剪切力下對(duì)VWF依賴(lài)的血小板在膠原上的黏附作用影響。通過(guò)應(yīng)用剪切力為1000S—1的Flow chamber試驗(yàn)，經(jīng)肝素抗凝的人全血在已包被人胎盤(pán)或牛皮膚Ⅲ型膠原的小室中灌注，

16、然后在顯微鏡下觀察單抗SZ—123和SZ—125對(duì)血小板在膠原表面上粘附的影響。同時(shí)，在上述相同剪切力下觀察單抗SZ—123和SZ—125對(duì)血小板在固相化VWF表面上粘附的影響。Flow chamber試驗(yàn)顯示SZ—123和SZ—125分別抑制高剪切力下人血小板在人胎盤(pán)或牛皮膚Ⅲ型膠原上的粘附。SZ—123和SZ—125抑制人血小板粘附到人胎盤(pán)膠原上的IC50值分別是3.6±0.5μg/ml和10.3±4.8μg/ml，而粘附到牛皮膚膠

17、原上的IC50值分別是3.1±0.6μg/ml和11.3±3.6μg/ml。有趣的是SZ—123和SZ—125不抑制高剪切力下人血小板在固相化VWF表面上的粘附。至于SZ—123和SZ—125如何調(diào)節(jié)VWF A1區(qū)功能，VWF A1和A3區(qū)的構(gòu)型和功能之間的關(guān)系我們需要作進(jìn)一步的研究和探討。 總之，我們研制和鑒定了兩株新型的VWF A3區(qū)特異性單抗SZ—123和SZ—125。SZ—123和SZ—125不僅抑制在靜止和流動(dòng)條件下V