大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端組織成牙能力的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物牙根發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，包括：牙根發(fā)育啟動(dòng)、牙根延長(zhǎng)并建立牙周附著關(guān)系、牙齒萌出直至咬合關(guān)系建立、最后牙根發(fā)育完成、根尖孔閉合。在人類，牙根發(fā)育持續(xù)至牙齒萌出后的3－5年。然而，目前大量相關(guān)研究集中在牙根發(fā)育的啟動(dòng)階段，對(duì)于牙根啟動(dòng)后至發(fā)育完成這一長(zhǎng)期而復(fù)雜的過(guò)程的研究非常少。然而在這一過(guò)程中，牙根進(jìn)一步發(fā)育同時(shí)伴有牙周組織形成及牙周附著的建立，從而使牙根及牙周組織形成一個(gè)功能單位被錨定在頜骨上。因此，對(duì)于牙根發(fā)育啟動(dòng)后至發(fā)育

2、完成這一時(shí)期的研究，特別是對(duì)牙根及牙周組織共同發(fā)育機(jī)制的探討是非常必要的。
　　牙根及牙周組織共同的發(fā)育依賴于發(fā)育期牙根的根端組織持續(xù)增殖并分化。在結(jié)構(gòu)上，發(fā)育期牙根的根端組織包含雙層上皮細(xì)胞構(gòu)成的鞘樣結(jié)構(gòu)，即Hertwig上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS）。上皮根鞘將其下方的外胚間充質(zhì)組織劃分為牙乳頭及牙囊，牙乳頭形成根部牙本質(zhì)及牙髓，牙囊則形成牙周組織。盡管這個(gè)區(qū)域的細(xì)胞在構(gòu)成上具

3、有異質(zhì)性的特征，然而，存在于這三種成分間的相互作用及各自的功能對(duì)于建立結(jié)構(gòu)完整的牙根／牙周復(fù)合體是必須的。因此，發(fā)育期牙根的根端組織似乎成為一個(gè)發(fā)育上的復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體由多種相互作用，密切相關(guān)的細(xì)胞類型構(gòu)成的，我們將其命名為發(fā)育期牙根的根端復(fù)合體（developingapicalcomplex，DAC）。
　　本課題旨在通過(guò)對(duì)大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端復(fù)合體－DAC的組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)觀察，探討DAC在原位的組織學(xué)特征，以及體外分離、培

4、養(yǎng)的DAC細(xì)胞的生物學(xué)特性，并進(jìn)一步將DAC組織與細(xì)胞分別進(jìn)行同種異體大鼠腎被膜下移植，明確DAC在體內(nèi)是否具有繼續(xù)發(fā)育能力，以及分化成為牙根／牙周組織形成細(xì)胞并在體內(nèi)形成牙根及牙周組織的能力，并初步探討了HERS在牙根及牙周組織共同發(fā)育中的作用。最后，我們還比較了DAC與牙根發(fā)育早期及牙根發(fā)育完成期根端組織的組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)及成牙能力的差異，以明確DAC在發(fā)育學(xué)上的特征。
　　第一部分大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端復(fù)合體－DAC在原位的組

5、織學(xué)觀察
　　實(shí)驗(yàn)一、采用組織學(xué)方法系統(tǒng)觀察了牙根發(fā)育早期（PN8d），發(fā)育期（PN21d）及發(fā)育完成期（PN35d），SD大鼠下頜第一磨牙牙根發(fā)育過(guò)程中根端組織的組織學(xué)特征。同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了牙根發(fā)育不同時(shí)期，HERS的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果表明：PN8d時(shí)，SD大鼠下頜第一磨牙HERS開(kāi)始形成，牙根發(fā)育啟動(dòng)；牙囊包繞成釉器與牙乳頭。此時(shí)的根端組織包括牙乳頭、HERS及部分牙囊。牙囊與牙乳頭間有明確的組織學(xué)界限。PN21d

6、時(shí)，牙根發(fā)育接近一半，HERS在根旁已經(jīng)斷裂，然而在牙本質(zhì)根尖末端及上皮隔的部位仍然保持完整。此時(shí)牙囊僅存在于發(fā)育期牙根的根端，與牙乳頭相連，兩種組織間失去了牙根啟動(dòng)時(shí)存在的明確的組織學(xué)界限，而成為一個(gè)組織結(jié)構(gòu)上的整體，因此將其命名為發(fā)育期根端復(fù)合體。PN35d時(shí)，HERS完全斷裂并消失，牙根發(fā)育完成。
　　實(shí)驗(yàn)二、采用組織學(xué)及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了發(fā)育期牙根的根端復(fù)合體－DAC在原位的組織學(xué)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DAC呈現(xiàn)出細(xì)胞濃聚的

7、現(xiàn)象，這種細(xì)胞濃聚有利于細(xì)胞－細(xì)胞，細(xì)胞－基質(zhì)間相互作用，從而有利于組織形態(tài)發(fā)生；DAC包含大量具有高增殖活性的未分化間充質(zhì)前體／干細(xì)胞，提示DAC較其鄰近的成體牙髓組織（dentalpulp,DP）具有更為“胚胎性”的特征；DAC表達(dá)多種牙本質(zhì)，骨／牙骨質(zhì)相關(guān)的礦化蛋白，提示DAC細(xì)胞不僅具有成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的潛力，同時(shí)也具有成骨／成牙骨質(zhì)向分化的潛力。
　　第二部分DAC細(xì)胞分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性的初步研究
　　實(shí)驗(yàn)一

8、、采用顯微機(jī)械法分離了PN21d齡SD大鼠下頜第一磨牙根端復(fù)合體－DAC，并使用抗CK-14免疫組化染色觀察離體的DAC組織中是否包含HERS結(jié)構(gòu)。并采用酶消化法分離培養(yǎng)了原代DAC細(xì)胞及牙髓細(xì)胞（dentalpulpcells,DP細(xì)胞）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：離體的DAC組織包含結(jié)構(gòu)完整的HERS及間充質(zhì)組織，表明本實(shí)驗(yàn)使用的分離方法能夠完整分離DAC組織；原代培養(yǎng)的DAC細(xì)胞包含典型的上皮樣細(xì)胞及間充質(zhì)樣細(xì)胞。間充質(zhì)樣細(xì)胞接種后迅速貼壁，伸展

9、后呈長(zhǎng)梭形或三角形。上皮樣細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞連接緊密，聚集在一起呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞排列成鋪路石樣。間充質(zhì)樣細(xì)胞分散在上皮樣細(xì)胞團(tuán)周圍，使上皮樣細(xì)胞呈“島”樣分布。原代培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞均為間充質(zhì)樣細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或三角形，未見(jiàn)上皮樣細(xì)胞存在。
　　實(shí)驗(yàn)二、采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入增殖細(xì)胞及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布等方法，檢測(cè)了DAC細(xì)胞在體外的增殖能力，并與牙髓細(xì)胞－DP的增殖能力作了對(duì)比分析，從而明確DAC細(xì)胞在體外的增殖

10、特性以及發(fā)育期組織與成體組織細(xì)胞間增殖能力的差異。結(jié)果表明：DAC細(xì)胞的增殖能力顯著高于成體牙髓細(xì)胞，相比較，幾乎全部的牙髓細(xì)胞都處于靜息狀態(tài)。提示發(fā)育期組織來(lái)源的細(xì)胞較之成體細(xì)胞具有更高的增殖能力；此外，DAC作為成體環(huán)境中的發(fā)育期組織，具有“胚胎性”組織的特征。
　　實(shí)驗(yàn)三、采用ALP活性檢測(cè)、礦化結(jié)節(jié)染色及RT-PCR檢測(cè)礦化相關(guān)基因表達(dá)的方法，檢測(cè)了原代培養(yǎng)的DAC細(xì)胞在體外的礦化及分化能力。使用牙髓細(xì)胞－DP作為對(duì)照，分

11、析了發(fā)育期組織與成體組織細(xì)胞間礦化及分化能力的差異。結(jié)果表明：DAC細(xì)胞在體外顯示了較牙髓細(xì)胞更高的礦化能力。并且高表達(dá)成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)／成骨細(xì)胞的標(biāo)志基因，提示DAC細(xì)胞不同于牙髓細(xì)胞，不僅存在成牙本質(zhì)細(xì)胞向的分化，也存在成骨／成牙骨質(zhì)細(xì)胞向的分化。
　　第三部分DAC組織及細(xì)胞的體內(nèi)種植研究及HERS作用的探討
　　實(shí)驗(yàn)一、將離體的完整DAC組織與牙髓組織分別進(jìn)行了同種異體大鼠腎被膜下移植，以明確DAC組織在體內(nèi)是

12、否具有獨(dú)立發(fā)育能力，并且能夠重現(xiàn)有序的牙根及牙周組織形態(tài)發(fā)生。結(jié)果表明：DAC組織移植物在異位環(huán)境中重現(xiàn)了正確的牙根及牙周組織形態(tài)發(fā)生，形成了結(jié)構(gòu)完整的，包含牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜及骨樣組織的牙根－牙周復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。提示DAC組織在異位環(huán)境下能夠繼續(xù)發(fā)育，并發(fā)育成為形態(tài)正確的牙根及牙周組織。牙髓組織移植物僅發(fā)育成為不規(guī)則的牙本質(zhì)／牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。
　　實(shí)驗(yàn)二、將原代DAC細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)差別消化培養(yǎng)，獲得了純化的上皮細(xì)胞（HERS）

13、及間充質(zhì)DAC細(xì)胞，經(jīng)Westernblot鑒定排除了上皮與間充質(zhì)細(xì)胞間的污染，并將包含HERS細(xì)胞的DACCs（HERS＋間充質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)）與不包含HERS細(xì)胞的DACCs-M（僅間充質(zhì)細(xì)胞），分別與陶瓷化牛骨（ceramicbovinebone,CBB）復(fù)合后進(jìn)行同種異體大鼠腎被膜下移植，以探討HERS在牙根及牙周組織發(fā)育中的作用。結(jié)果表明：包含HERS細(xì)胞的DACCs移植物形成了形態(tài)良好的牙根及牙周組織樣的結(jié)構(gòu)，包括牙本質(zhì)、牙骨

14、質(zhì)、牙周膜及骨樣組織。然而，去除了HERS細(xì)胞的DACCs-M移植物僅形成了沒(méi)有牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)的骨樣牙本質(zhì)，以及無(wú)規(guī)則排列的纖維樣組織。提示HERS在牙根及牙周組織發(fā)育中起重要的作用，同時(shí)也揭示了DAC作為一個(gè)功能性的整體在牙根及牙周組織共同發(fā)育中起作用，而DAC中每一種細(xì)胞成分對(duì)于牙根－牙周復(fù)合體的形成都是必需的。
　　第四部分DAC與牙根啟動(dòng)期及完成期根端組織的對(duì)比研究
　　實(shí)驗(yàn)一、采用顯微機(jī)械分離、酶消化法原代培養(yǎng)了D

15、AC細(xì)胞（PN21d）及牙根發(fā)育啟動(dòng)期（PN8d）、發(fā)育完成期（PN35d）的根端組織細(xì)胞，并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布、ALP活性檢測(cè)、礦化結(jié)節(jié)染色及RT-PCR基因表達(dá)檢測(cè)等方法對(duì)比了DAC細(xì)胞與牙根啟動(dòng)期、完成期根端組織細(xì)胞，在體外細(xì)胞增殖、礦化及分化能力上的差異。結(jié)果表明：DAC細(xì)胞具有類似于牙根啟動(dòng)期根端組織細(xì)胞的極高的細(xì)胞增殖能力；其礦化能力較牙根啟動(dòng)期的根端組織細(xì)胞更高。并且這兩個(gè)時(shí)期礦化相關(guān)蛋白mRNA的表

16、達(dá)也存在差異，DAC細(xì)胞不僅表達(dá)牙根-牙周組織前體細(xì)胞的標(biāo)志分子，還表達(dá)分化成熟的牙根-牙周組織形成細(xì)胞的標(biāo)志分子。提示DAC中不僅存在形成牙根及牙周組織的前體細(xì)胞群，還包含分化成熟的牙根／牙周組織形成細(xì)胞。然而，DAC細(xì)胞在體外的極高的發(fā)育潛力在牙根發(fā)育完成期的根端組織細(xì)胞中不存在。
　　實(shí)驗(yàn)二、將原代培養(yǎng)的DAC細(xì)胞、牙根啟動(dòng)期及完成期根端組織細(xì)胞分別與CBB復(fù)合后進(jìn)行同種異體大鼠腎被膜下移植，以探討DAC細(xì)胞與牙根啟動(dòng)期、完