下調(diào)PTEN對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是由腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥，以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，所以有效改善患者的學(xué)習(xí)記憶功能是血管性癡呆研究的重點(diǎn)和突破點(diǎn)所在。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PTEN

2、表達(dá)對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用，且作為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)因子，PTEN在神經(jīng)元分化、樹突分枝及突觸可塑性方面也可發(fā)揮重要作用。因此，預(yù)測(cè)將其下調(diào)有可能參與改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。本課題利用PTEN特異性RNAi（RNA interference，RNA干擾）的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染血管性癡呆大鼠模型，選擇與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-bindingprote

3、in，CREB）為切入點(diǎn)，觀察PTEN基因沉默對(duì)癡呆海馬區(qū)的病理改變、CREB表達(dá)變化以及學(xué)習(xí)記憶能力的改善，闡明PTEN在血管性癡呆突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶中的重要作用，以期為臨床血管性癡呆的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用人胚腎293細(xì)胞擴(kuò)增PTEN特異性RNAi的重組腺病毒AdR-siPTEN，采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化病毒并測(cè)定其滴度；
　　 2.分別用適當(dāng)劑量的重組腺病毒和空病毒（陰性

4、對(duì)照）轉(zhuǎn)染缺血癡呆大鼠海馬組織，熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)，RT-PCR及Western blotting檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染后PTEN基因表達(dá)下降情況，探明RNAi對(duì)PTEN的抑制效率；
　　 3.40只SD大鼠隨機(jī)分為缺血癡呆組（VD組），假手術(shù)組和腺病毒處理組（siPTEN組），陰性對(duì)照組（AdRFP組）。4周后分別應(yīng)用水迷宮、HE和Nissl染色檢測(cè)各組大鼠行為學(xué)及組織病理形態(tài)學(xué)變化，觀察下調(diào)PTEN對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功

5、能的影響；
　　 4.應(yīng)用RT-PCR及免疫組化分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)。PTEN表達(dá)下調(diào)后海馬區(qū)Akt、CREB表達(dá)的變化，探討下調(diào)PTEN對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元CREB表達(dá)的影響，從而探討PTEN基因改善缺血癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到明確的紅色熒光，擴(kuò)增并純化后AdR-siPTEN的滴度為：3.36x1010 pfu/ml

6、；AdRFP的滴度為：2.98×1010pfu/ml。
　　 2.轉(zhuǎn)染腺病毒一定時(shí)限后，大鼠海馬組織均出現(xiàn)紅色熒光蛋白陽性表達(dá)；RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，缺血癡呆后，PTEN mRNA和蛋白水平明顯增高（p<0.01），腺病毒干預(yù)后PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)（p<0.01），而陰性對(duì)照組中PTEN表達(dá)無明顯變化（p>0.05）；
　　 3.水迷宮檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺血癡呆后大鼠逃避潛

7、伏期明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，經(jīng)siPPTEN處理后延長(zhǎng)的逃避潛伏期縮短，減少的跨越平臺(tái)次數(shù)增多（P<0.01）；與AdRFP組比較，siPTEN組逃避潛伏期也明顯縮短，跨平臺(tái)次數(shù)顯著增多（P<0.01）；Nissl染色顯示，siPTEN組海馬神經(jīng)元損傷程度明顯輕于VD和AdRFP組大鼠；HE染色后光鏡下觀察，siPTEN組海馬變性程度較VD和AdRFP組明顯減輕，其結(jié)果與Nissl染色結(jié)果相吻合；
　　 4.RT-PCR

8、及免疫組化分別檢測(cè)CREB mRNA基因表達(dá)和蛋白水平結(jié)果均顯示：siPTEN組海馬部位CREB水平較AdRFP組明顯升高，但未至正常水平（p<0.01），表明siPTEN組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙得到改善可能與海馬區(qū)CREB表達(dá)升高有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用293細(xì)胞成功擴(kuò)增了大量重組腺病毒AdR-siPTEN以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 2.腺病毒能高效感染海馬組織，有效進(jìn)行PTEN特異性siRNA基因