PEDF重組蛋白及PEDF基因靶向傳輸在抗腫瘤生長和血管增生中的作用及機制研究.pdf

1、本研究擬采用PEDF重組蛋白和PEDF基因靶向傳輸兩種手段，探討PEDF在抗腫瘤生長和血管增生中的作用及可能機制。研究圍繞以下兩方面進行：
　　 (1)觀察PEDF重組蛋白對宮頸癌的治療作用，并探討其可能機制。
　　 (2)通過靶向腫瘤新生血管的納米載體cRGD-PEG-PEI傳輸PEDF基因，觀察在結直腸癌中的治療效果，并初步探討其可能機制。
　　 主要研究內容和結果如下：
　　 第一部分 PEDF重組

2、蛋白通過抗血管增生抑制宮頸癌的生長
　　 1. PEDF在人宮頸癌組織中的表達降低免疫組織化學分析顯示，PEDF蛋白在人正常宮頸的鱗狀上皮組織和宮頸癌的癌旁非增生的鱗狀上皮組織內均有較強的表達，然而，在宮頸鱗狀上皮細胞癌癌巢內PEDF的陽性染色則很少，PEDF表達水平降低至正常宮頸鱗狀上皮組織和癌旁非增生的鱗狀上皮組織的6％左右(P＜0.01)。
　　 2.PEDF重組蛋白的表達和純化將含PEDF-pET-30a(+)重

3、組質粒的BL21(DE3)宿主菌，25℃用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后，提取細菌裂解產物的可溶部分，Ni2+-His Bind Resin親和柱純化獲得含有6×His-tag的PEDF重組蛋白。用凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描，結果顯示純化后重組蛋白純度可達95％左右。用兔抗人PEDF抗體進行免疫印跡(Western blotting)分析得到分子量約為50 kDa的免疫雜交條帶。
　　 3.PEDF在人宮頸癌裸鼠異

4、位移植瘤模型中抑制腫瘤的生長與PBS對照組相比，PEDF處理組腫瘤生長較慢，在種瘤后第30天處死裸鼠，剝離腫瘤，稱瘤重。結果顯示：總劑量為15 mg/kg的PEDF蛋白對BALB/c裸鼠宮頸癌實體瘤的生長具有明顯的抑制作用，抑瘤率為68％(P＜0.01)。
　　 4.PEDF在人宮頸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤血管增生PEDF對腫瘤血管增生的作用通過對裸鼠腫瘤組織內免疫組織化學染色呈棕黃色的CD34(+)微血管的密度進行評價。

5、結果顯示PEDF處理組腫瘤組織中微血管密度明顯低于PBS對照組(P＜0.01)。
　　 5.PEDF選擇性抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的增殖噻唑藍(MTT)比色法分析PEDF對HUVECs和宮頸癌細胞HeLa的增殖作用。結果顯示，PEDF在10 mol/L即可抑制HUVECs的增殖，并隨濃度增高呈明顯的劑量依賴關系(P＜0.01)，IC50為200 nmol/L。而用PEDF處理常氧或低氧條件下培養(yǎng)的HeLa細胞，發(fā)現(xiàn)即

6、使在640 nmol/L的高劑量組同對照組相比細胞存活率也沒有明顯差別。
　　 6.PEDF特異性誘導HUVECs凋亡用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)雙染標記細胞，利用流式細胞儀分析PEDF對HUVECs和HeLa的凋亡作用。結果顯示，200nmol/L的PEDF處理24 h的HUVECs細胞凋亡率為17.2±2.7％，明顯高于PBS對照組6.5±0.5％(P＜0.01)。而常氧和低氧條件下，320 nmol

7、/L的PEDF處理48 h的HeLa細胞調亡率與PBS對照組相比均無明顯差異。
　　 7.PEDF下調HeLa細胞中VEGF的表達免疫細胞化學和Westernblotting分析HeLa細胞中VEGF的表達。結果顯示，低氧誘導HeLa細胞中VEGF的表達增高，80 nmol/L以上濃度的PEDF能夠劑量依賴性地抑制低氧下HeLa細胞中VEGF的表達(P＜0.01)。
　　 8.PEDF抑制HeLa細胞中HIF-1α的表達

8、及核轉位免疫細胞化學和Western blotting分析HeLa細胞中HIF-1α的表達。結果顯示：常氧下培養(yǎng)的HeLa細胞HIF-1α表達很低，且主要位于胞漿；低氧處理的HeLa細胞HIF-1α表達明顯增高，以細胞核尤為明顯；用320 nmol/L的PEDF處理后，可見HeLa細胞中HIF-1α的表達明顯降低，且主要位于胞漿(P＜0.01)。表明PEDF可以抑制低氧誘導的HeLa細胞中HIF-1α的表達及核轉位。
　　 第二

9、部分納米載體靶向傳輸PEDF基因治療結直腸癌的研究
　　 1.納米載體PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI的合成本研究以聚乙烯亞胺(PEI)為納米載體骨架，用聚乙二醇(PEG)修飾以避免自身聚集降低毒性，并結合特異靶向于整合素αvβ3的cRGD肽，構建了靶向腫瘤新生血管的納米載體cRGD-PEG-PEI，經核磁共振氫譜(1H NMR)分析證實成功合成目標產物。
　　 2.真核表達質粒PEDF-pcDNA3.1(+)和

10、PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)的構建本研究中構建了PEDF-pcDNA3.1(+)以表達內源性PEDF蛋白，同時還構建了EGFP-pcDNA3.1(+)和PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)以表達綠色熒光蛋白(GFP)以及PEDF-GFP融合蛋白，便于觀察基因轉染效果，經PCR、雙酶切鑒定和測序比對證實目的基因已成功插入到載體的多克隆位點，沒有出現(xiàn)移碼突變。
　　 3.納米載體能夠有效縮合質粒DNA至納米級粒徑

11、粒徑測定和凝膠電泳阻滯實驗結果顯示：隨著N/P比值逐漸增高，陽離子聚合物納米載體通過靜電作用逐漸有效縮合帶負電的質粒DNA。cRGD-PEG-PEI與PEG-PEI的相比，縮合質粒DNA的能力有所下降，兩者分別在N/P≥4和N/P≥2時不再出現(xiàn)質粒電泳條帶，在N/P≥10和N/P≥7時得到的復合物粒徑在100nm以內，可能原因是靶向分子cRGD的立體構象造成的空間位阻影響到納米載體縮合質粒DNA的過程。
　　 4.納米載體在一定

12、條件下具有最佳的基因轉染效果納米載體的基因傳輸效率首先在易于轉染的HEK-293細胞進行評價。MTT毒性實驗結果顯示，在N/P≥30后納米復合物與未轉染對照組相比產生明顯細胞毒性，細胞存活率在N/P=30時約90％，在N/P=60時約60％。納米載體的基因轉染效率在N/P=4、7、10時依次增高，N/P≥10后增加不明顯。PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI在相同N/P比值的細胞毒性、轉染效率均無明顯差異。
　　 5.cRG

13、D-PEG-PEI在HUVECs細胞的基因靶向傳輸流式細胞計數(shù)結果顯示：在相同N/P比時，cRGD-PEG-PEI和PEG-PEI對HEK-293的轉染效率無明顯差異；對HUVECs細胞的轉染效率eRGD-PEG-PEI(53.7±3.3％)是PEG-PEI(19.5±1.2％)的兩倍以上(P＜0.01)。cRGD-PEG-PEI轉染同時加入過量游離cRGD后，轉染效率明顯降低(P＜0.01)，且與相同N/P時PEG-PEI的轉染效率相

14、比無明顯差異。表明cRGD-PEG-PEI與PEG-PEI相比轉染效率的增高是由靶向分子cRGD所介導。
　　 6.兩種PEDF的真核表達質粒均可以表達PEDF蛋白，但PEDF-GFP融合蛋白在細胞內表達后不能分泌至細胞外Western blotting結果顯示，兩種PEDF的真核表達質粒轉染HEK-293和HUVECs細胞后均能檢測到細胞總蛋白中PEDF蛋白的表達。而且熒光顯微鏡下可觀察到PEDF-GFP融合蛋白在細胞胞漿的表

15、達。然而，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測結果發(fā)現(xiàn)僅PEDF-pcDNA3.1(+)轉染細胞后的培養(yǎng)液上清中有PEDF蛋白的分泌，PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)轉染細胞后表達的PEDF-GFP融合蛋白未分泌至培養(yǎng)液上清中，可能C端融合表達GFP蛋白影響了PEDF的分泌。
　　 7.cRGD-PEG-PEI靶向傳輸PEDF基因在人結直腸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤的生長與生理鹽水組及空質粒對照組相比，PEDF組腫瘤

16、生長較慢。在種瘤后第30天處死裸鼠，剝離腫瘤，稱瘤重。結果顯示：經瘤周注射總劑量為3.75 mg/kg的PEDF-pcDNA3.1(+)與N/P=15的cRGD-PEG-PEI的復合物進行治療后，對結直腸癌原發(fā)瘤的生長具有明顯的抑制作用，平均抑制率為67.4％(P＜0.01)。
　　 8.cRGD-PEG-PEI靶向傳輸PEDF基因在人結直腸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤血管增生PEDF對腫瘤血管增生的作用通過對裸鼠腫瘤組織內免

17、疫組織化學染色呈棕黃色的CD34(+)微血管的密度進行評價。結果顯示PEDF處理組腫瘤組織中微血管密度明顯低于生理鹽水組及空質粒對照組(P＜0.01)。
　　 9.PEDF重組蛋白對人結直腸癌細胞SW620的增殖沒有直接抑制作用用PEDF重組蛋白處理SW620細胞，發(fā)現(xiàn)包括640 nmol/L的高劑量組在內的各PEDF處理組同對照組相比細胞存活率均沒有明顯差別。提示PEDF對人結直腸癌細胞SW620的生長并無直接抑制作用。

18、>　　 結論及研究意義：
　　 1.PEDF重組蛋白通過抗血管增生抑制宮頸癌的生長。
　　 2.PEDF通過抑制HIF-1α來下調腫瘤細胞中VEGF的表達，削弱VEGF對腫瘤組織中新生血管內皮細胞的旁分泌效應，可能是PEDF抗腫瘤活性的一個新機制。
　　 3.PEDF基因靶向傳輸通過抗血管增生抑制結直腸癌的生長。
　　 4.通過靶向整合素αvβ3的cRGD配體修飾的納米載體實現(xiàn)針對腫瘤新生血管的基因靶向