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
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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究擬采用PEDF重組蛋白和PEDF基因靶向傳輸兩種手段,探討PEDF在抗腫瘤生長(zhǎng)和血管增生中的作用及可能機(jī)制。研究圍繞以下兩方面進(jìn)行:
(1)觀察PEDF重組蛋白對(duì)宮頸癌的治療作用,并探討其可能機(jī)制。
(2)通過(guò)靶向腫瘤新生血管的納米載體cRGD-PEG-PEI傳輸PEDF基因,觀察在結(jié)直腸癌中的治療效果,并初步探討其可能機(jī)制。
主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
第一部分 PEDF重組
2、蛋白通過(guò)抗血管增生抑制宮頸癌的生長(zhǎng)
1. PEDF在人宮頸癌組織中的表達(dá)降低免疫組織化學(xué)分析顯示,PEDF蛋白在人正常宮頸的鱗狀上皮組織和宮頸癌的癌旁非增生的鱗狀上皮組織內(nèi)均有較強(qiáng)的表達(dá),然而,在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌癌巢內(nèi)PEDF的陽(yáng)性染色則很少,PEDF表達(dá)水平降低至正常宮頸鱗狀上皮組織和癌旁非增生的鱗狀上皮組織的6%左右(P<0.01)。
2.PEDF重組蛋白的表達(dá)和純化將含PEDF-pET-30a(+)重
3、組質(zhì)粒的BL21(DE3)宿主菌,25℃用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后,提取細(xì)菌裂解產(chǎn)物的可溶部分,Ni2+-His Bind Resin親和柱純化獲得含有6×His-tag的PEDF重組蛋白。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描,結(jié)果顯示純化后重組蛋白純度可達(dá)95%左右。用兔抗人PEDF抗體進(jìn)行免疫印跡(Western blotting)分析得到分子量約為50 kDa的免疫雜交條帶。
3.PEDF在人宮頸癌裸鼠異
4、位移植瘤模型中抑制腫瘤的生長(zhǎng)與PBS對(duì)照組相比,PEDF處理組腫瘤生長(zhǎng)較慢,在種瘤后第30天處死裸鼠,剝離腫瘤,稱瘤重。結(jié)果顯示:總劑量為15 mg/kg的PEDF蛋白對(duì)BALB/c裸鼠宮頸癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,抑瘤率為68%(P<0.01)。
4.PEDF在人宮頸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤血管增生PEDF對(duì)腫瘤血管增生的作用通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤組織內(nèi)免疫組織化學(xué)染色呈棕黃色的CD34(+)微血管的密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
5、結(jié)果顯示PEDF處理組腫瘤組織中微血管密度明顯低于PBS對(duì)照組(P<0.01)。
5.PEDF選擇性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖噻唑藍(lán)(MTT)比色法分析PEDF對(duì)HUVECs和宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖作用。結(jié)果顯示,PEDF在10 mol/L即可抑制HUVECs的增殖,并隨濃度增高呈明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.01),IC50為200 nmol/L。而用PEDF處理常氧或低氧條件下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)即
6、使在640 nmol/L的高劑量組同對(duì)照組相比細(xì)胞存活率也沒有明顯差別。
6.PEDF特異性誘導(dǎo)HUVECs凋亡用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)雙染標(biāo)記細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀分析PEDF對(duì)HUVECs和HeLa的凋亡作用。結(jié)果顯示,200nmol/L的PEDF處理24 h的HUVECs細(xì)胞凋亡率為17.2±2.7%,明顯高于PBS對(duì)照組6.5±0.5%(P<0.01)。而常氧和低氧條件下,320 nmol
7、/L的PEDF處理48 h的HeLa細(xì)胞調(diào)亡率與PBS對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異。
7.PEDF下調(diào)HeLa細(xì)胞中VEGF的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblotting分析HeLa細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。結(jié)果顯示,低氧誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中VEGF的表達(dá)增高,80 nmol/L以上濃度的PEDF能夠劑量依賴性地抑制低氧下HeLa細(xì)胞中VEGF的表達(dá)(P<0.01)。
8.PEDF抑制HeLa細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)
8、及核轉(zhuǎn)位免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting分析HeLa細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)。結(jié)果顯示:常氧下培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞HIF-1α表達(dá)很低,且主要位于胞漿;低氧處理的HeLa細(xì)胞HIF-1α表達(dá)明顯增高,以細(xì)胞核尤為明顯;用320 nmol/L的PEDF處理后,可見HeLa細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)明顯降低,且主要位于胞漿(P<0.01)。表明PEDF可以抑制低氧誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。
第二
9、部分納米載體靶向傳輸PEDF基因治療結(jié)直腸癌的研究
1.納米載體PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI的合成本研究以聚乙烯亞胺(PEI)為納米載體骨架,用聚乙二醇(PEG)修飾以避免自身聚集降低毒性,并結(jié)合特異靶向于整合素αvβ3的cRGD肽,構(gòu)建了靶向腫瘤新生血管的納米載體cRGD-PEG-PEI,經(jīng)核磁共振氫譜(1H NMR)分析證實(shí)成功合成目標(biāo)產(chǎn)物。
2.真核表達(dá)質(zhì)粒PEDF-pcDNA3.1(+)和
10、PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)的構(gòu)建本研究中構(gòu)建了PEDF-pcDNA3.1(+)以表達(dá)內(nèi)源性PEDF蛋白,同時(shí)還構(gòu)建了EGFP-pcDNA3.1(+)和PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)以表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)以及PEDF-GFP融合蛋白,便于觀察基因轉(zhuǎn)染效果,經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序比對(duì)證實(shí)目的基因已成功插入到載體的多克隆位點(diǎn),沒有出現(xiàn)移碼突變。
3.納米載體能夠有效縮合質(zhì)粒DNA至納米級(jí)粒徑
11、粒徑測(cè)定和凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著N/P比值逐漸增高,陽(yáng)離子聚合物納米載體通過(guò)靜電作用逐漸有效縮合帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA。cRGD-PEG-PEI與PEG-PEI的相比,縮合質(zhì)粒DNA的能力有所下降,兩者分別在N/P≥4和N/P≥2時(shí)不再出現(xiàn)質(zhì)粒電泳條帶,在N/P≥10和N/P≥7時(shí)得到的復(fù)合物粒徑在100nm以內(nèi),可能原因是靶向分子cRGD的立體構(gòu)象造成的空間位阻影響到納米載體縮合質(zhì)粒DNA的過(guò)程。
4.納米載體在一定
12、條件下具有最佳的基因轉(zhuǎn)染效果納米載體的基因傳輸效率首先在易于轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在N/P≥30后納米復(fù)合物與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性,細(xì)胞存活率在N/P=30時(shí)約90%,在N/P=60時(shí)約60%。納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率在N/P=4、7、10時(shí)依次增高,N/P≥10后增加不明顯。PEG-PEI和cRGD-PEG-PEI在相同N/P比值的細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率均無(wú)明顯差異。
5.cRG
13、D-PEG-PEI在HUVECs細(xì)胞的基因靶向傳輸流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:在相同N/P比時(shí),cRGD-PEG-PEI和PEG-PEI對(duì)HEK-293的轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯差異;對(duì)HUVECs細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率eRGD-PEG-PEI(53.7±3.3%)是PEG-PEI(19.5±1.2%)的兩倍以上(P<0.01)。cRGD-PEG-PEI轉(zhuǎn)染同時(shí)加入過(guò)量游離cRGD后,轉(zhuǎn)染效率明顯降低(P<0.01),且與相同N/P時(shí)PEG-PEI的轉(zhuǎn)染效率相
14、比無(wú)明顯差異。表明cRGD-PEG-PEI與PEG-PEI相比轉(zhuǎn)染效率的增高是由靶向分子cRGD所介導(dǎo)。
6.兩種PEDF的真核表達(dá)質(zhì)粒均可以表達(dá)PEDF蛋白,但PEDF-GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后不能分泌至細(xì)胞外Western blotting結(jié)果顯示,兩種PEDF的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293和HUVECs細(xì)胞后均能檢測(cè)到細(xì)胞總蛋白中PEDF蛋白的表達(dá)。而且熒光顯微鏡下可觀察到PEDF-GFP融合蛋白在細(xì)胞胞漿的表
15、達(dá)。然而,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅PEDF-pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的培養(yǎng)液上清中有PEDF蛋白的分泌,PEDF-EGFP-pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)的PEDF-GFP融合蛋白未分泌至培養(yǎng)液上清中,可能C端融合表達(dá)GFP蛋白影響了PEDF的分泌。
7.cRGD-PEG-PEI靶向傳輸PEDF基因在人結(jié)直腸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤的生長(zhǎng)與生理鹽水組及空質(zhì)粒對(duì)照組相比,PEDF組腫瘤
16、生長(zhǎng)較慢。在種瘤后第30天處死裸鼠,剝離腫瘤,稱瘤重。結(jié)果顯示:經(jīng)瘤周注射總劑量為3.75 mg/kg的PEDF-pcDNA3.1(+)與N/P=15的cRGD-PEG-PEI的復(fù)合物進(jìn)行治療后,對(duì)結(jié)直腸癌原發(fā)瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,平均抑制率為67.4%(P<0.01)。
8.cRGD-PEG-PEI靶向傳輸PEDF基因在人結(jié)直腸癌裸鼠異位移植瘤模型中抑制腫瘤血管增生PEDF對(duì)腫瘤血管增生的作用通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤組織內(nèi)免
17、疫組織化學(xué)染色呈棕黃色的CD34(+)微血管的密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示PEDF處理組腫瘤組織中微血管密度明顯低于生理鹽水組及空質(zhì)粒對(duì)照組(P<0.01)。
9.PEDF重組蛋白對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的增殖沒有直接抑制作用用PEDF重組蛋白處理SW620細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)包括640 nmol/L的高劑量組在內(nèi)的各PEDF處理組同對(duì)照組相比細(xì)胞存活率均沒有明顯差別。提示PEDF對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的生長(zhǎng)并無(wú)直接抑制作用。
18、> 結(jié)論及研究意義:
1.PEDF重組蛋白通過(guò)抗血管增生抑制宮頸癌的生長(zhǎng)。
2.PEDF通過(guò)抑制HIF-1α來(lái)下調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá),削弱VEGF對(duì)腫瘤組織中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的旁分泌效應(yīng),可能是PEDF抗腫瘤活性的一個(gè)新機(jī)制。
3.PEDF基因靶向傳輸通過(guò)抗血管增生抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。
4.通過(guò)靶向整合素αvβ3的cRGD配體修飾的納米載體實(shí)現(xiàn)針對(duì)腫瘤新生血管的基因靶向
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