短暫腦缺血再灌流后神經(jīng)細(xì)胞頓抑現(xiàn)象及其機(jī)制的研究.pdf

1、短暫腦缺血再灌流后神經(jīng)細(xì)胞頓抑現(xiàn)象及其機(jī)制的研究導(dǎo)師:張?zhí)K明教授博士研究生:鄧曉紅華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科前言近年來人們在研究心肌短暫缺血再灌流時，發(fā)現(xiàn)頓抑心肌的存在國際上OvergaardK.曾推測在腦缺血早期階段自發(fā)出現(xiàn)或者誘導(dǎo)發(fā)生的再灌流后可能出現(xiàn)“大腦頓抑，(Cerebralstunning)現(xiàn)象，即神經(jīng)元暫時性功能障礙而非死亡的現(xiàn)象。雖然，在國際上超早期溶栓治療急性腦梗塞的臨床試驗(yàn)研究顯示有顯著的遠(yuǎn)期療效:但

2、是，從現(xiàn)有的資料可以得知，即使病人在腦缺血起病六小時內(nèi)及時地進(jìn)行溶栓治療，也并非所有的患者都能獲得很好的療效。有學(xué)者研究證實(shí):與對照組相比，臨床上超早期溶栓再灌流24小時后，患者神經(jīng)功能恢復(fù)的評分，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并無顯著性差異，但3月后追蹤觀察兩組的療效時則有顯著性的差異，這與國際上大宗試驗(yàn)的結(jié)果相似。而且在動物實(shí)驗(yàn)研究中也有類似發(fā)現(xiàn):治療組在超早期對自體血栓大腦中動脈阻塞鼠進(jìn)行尿激酶靜脈溶栓治療后，與未溶栓組動物比較，盡管缺血腦組織經(jīng)再灌

3、流后梗塞灶明顯減小，但兩組5小時及24小時神經(jīng)功能缺損評分均無顯著性差異，提示雖在缺血區(qū)重新恢復(fù)了灌流，但神經(jīng)功能并未很快恢復(fù)。由此可見，這種在短暫性缺血腦組織或在梗塞灶周邊半暗帶腦組織的再灌流損傷之后繼發(fā)出現(xiàn)的神經(jīng)功能延遲恢復(fù)的現(xiàn)象，極可能與一種以往未曾被充分認(rèn)識到的病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān)，值得腦卒中研究者高度重視，為此我們曾提出:超早期腦梗塞溶栓再灌流后的神經(jīng)功能恢復(fù)延遲現(xiàn)象的發(fā)生是否與缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)的“神經(jīng)細(xì)胞頓抑”有關(guān)，應(yīng)該深入研

4、究和證實(shí)之。我們推測這種神經(jīng)細(xì)胞頓抑現(xiàn)象在細(xì)胞及亞細(xì)胞機(jī)制方面與心肌頓抑的發(fā)生機(jī)制有些異同，并且可能更為復(fù)雜。它的出現(xiàn)不僅可能與缺血再灌流后神經(jīng)元華功群攪大學(xué)何濟(jì)醫(yī)學(xué)脫厚士研男t華業(yè)老戈中文摘要、、、、、、灸咖究目的在于建立穩(wěn)定高表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP，并能連續(xù)傳代的PC12GFP細(xì)胞株，研究GFP表達(dá)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞有無毒性作用，摸索在流式細(xì)胞儀上經(jīng)GFPPI雙標(biāo)分選GFP陽性活細(xì)胞并分析GFP陽性活細(xì)胞比例的方法。建立短暫缺氧血清剝奪復(fù)

5、氧復(fù)注血清后的神經(jīng)細(xì)胞頓抑模型，研究短暫缺氧血清剝奪復(fù)氧復(fù)注血清后有無神經(jīng)細(xì)胞頓抑現(xiàn)象存在及頓抑現(xiàn)象與能量代謝的關(guān)系及環(huán)抱菌素A對短暫缺氧血清剝奪復(fù)氧復(fù)注血清后的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，探討神經(jīng)細(xì)胞頓抑發(fā)生的可能機(jī)制及千預(yù)措施。法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFPN、質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PC12細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選和克隆轉(zhuǎn)移，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)通過比較普通PC12細(xì)胞和PC12GFP細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇及加入神經(jīng)生

6、長因子(NGF)后有無神經(jīng)樣突起長出等，進(jìn)一步對PC12GFP細(xì)胞株進(jìn)行鑒定并研究GFP表達(dá)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞有無毒性作用。將缺氧血清剝奪復(fù)氧復(fù)注血清后的PC12GFP細(xì)胞進(jìn)行PI標(biāo)記，標(biāo)記成功后在流式細(xì)胞儀上分選GFP陽性活細(xì)胞并分析GFP陽性活細(xì)胞比例，分選出GFP()PI()GFP()PI()GFP()PI亡)、GFP()PI()4組細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察分選后各組細(xì)胞形態(tài)并在激光共聚焦顯微鏡下照相。將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和缺氧組，在流式