miR-34a調(diào)控系膜增殖性腎炎的機(jī)制研究.pdf

1、背景:系膜增殖性腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是我國發(fā)病率最高的腎臟疾病之一。其主要的病理變化是彌漫性腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cell，GMC)增生，以及不同程度的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)增多。同時(shí)，MsPGN是導(dǎo)致慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的首要原因，可

2、引起大量蛋白尿、高血壓腎損害等一系列并發(fā)癥，如果病情繼續(xù)進(jìn)展惡化，還可引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，最終成為導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因。抑制系膜細(xì)胞增殖是治療系膜增殖性腎小球疾病重要的治療策略。近年來生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重大突破就是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA——microRNA(miRNA)。這些小RNA廣泛參與調(diào)控生物增殖/凋亡、發(fā)育/衰老等病理生理過程

3、，與人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前研究表明，miR—34a可能參與調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路而影響細(xì)胞的增殖。RNA干擾(RNAi)在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，可以迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉默中起中心作用，可對特定信使RNA(mRNA)進(jìn)行特異性的降解。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的元件。siRNA與miRNA具有眾多相似性，

4、所以利用siRNA模擬miRNA實(shí)驗(yàn)以證明miRNA對于靶基因作用的特異性。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）是細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的營養(yǎng)物質(zhì)，其中含有幾十種蛋白質(zhì)、微量元素、生長因子等。在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)通常采用10％-15％FBS進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中我們可以利用高濃度(20％) FBS培養(yǎng)細(xì)胞，以刺激細(xì)胞進(jìn)行過度增殖，與以往單一利用某種刺激因子比較，高濃度FBS更能模擬生物體內(nèi)病理情況復(fù)雜的環(huán)境。如果我們可以利用miR-34a可

5、以拮抗這一現(xiàn)象，可以推測其在體內(nèi)也可以有相似作用。
　　目的:制備抗Thy1抗體并制備抗Thy1系膜增殖性腎炎大鼠模型。觀察miR-34a在各病理時(shí)間點(diǎn)變化趨勢。之后，利用siPDGFR-β證明miR-34a對于已經(jīng)證明的靶基因PDGFR-β及Ras/MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用，并在體外證實(shí)miR-34a可以拮抗外源性刺激引起的細(xì)胞過度增殖現(xiàn)象。
　　方法:
　　1.利用OX-7雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生抗Thy1抗體，純化后經(jīng)

6、尾靜脈注射Wistar大鼠建立抗Thy1系膜增殖性腎炎大鼠模型。檢測不同病理時(shí)間點(diǎn)（第0、3、5、7、10、14天）腎功能和24小時(shí)尿蛋白定量;
　　2.利用免疫組化方法，檢測各病理時(shí)間點(diǎn)Ki67及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)變化趨勢;
　　3.留取各病理時(shí)間點(diǎn)腎臟組織并提取腎小球，Western Blot檢測G0/G1期細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、p27kip

7、1表達(dá)變化趨勢;
　　4.利用TaqMan Real-time PCR檢測各病理時(shí)間點(diǎn)miR-34a表達(dá)的變化趨勢;
　　5.將siPDGFR-β或siRNA negative control轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞系(RMC)，利用Cell Counting Kit-8方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)(24h，48h，72h)各組細(xì)胞增殖速率的變化程度;
　　6.將siPDGFR-β或siRNA negative control轉(zhuǎn)染大鼠系

8、膜細(xì)胞系（RMC）48h后，利用流式細(xì)胞儀檢測RMC細(xì)胞周期變化;
　　7.將siPDGFR-β或siRNA negative control轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞系(RMC)48h后，檢測靶基因PDGFR-β、Ras/MAPK信號(hào)通路的各個(gè)靶點(diǎn)K-ras、Raf1、p-Raf1、MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、p27kip1的蛋

9、白表達(dá)變化趨勢;
　　8.利用雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)檢測miR-34a對可能靶基因CDK2、cyclin E表達(dá)的調(diào)控作用;
　　9.利用高濃度胎牛血清(20％FBS)刺激轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的大鼠系膜細(xì)胞，利用Cell Counting Kit-8方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)(24h，48h，72h)各組細(xì)胞增殖速率的變化程度;
　　10.利用高濃度胎牛血清(20％FBS)刺激轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的大鼠

10、系膜細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測RMC細(xì)胞周期變化;
　　11.利用高濃度胎牛血清(20％FBS)刺激轉(zhuǎn)染miR-34a mimics的大鼠系膜細(xì)胞，檢測靶基因PDGFR-β、Ras/MAPK信號(hào)通路的各個(gè)靶點(diǎn)K-ras、Raf1、p-Raf1、MEK1、p-MEK1、ERK1/2、p-ERK1/2及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6、p27kip1的蛋白表達(dá)變化趨勢。
　　結(jié)果:<

11、br>　　1.成功制備抗Thy1抗體，并利用該抗體制備了抗Thy1系膜增殖性腎炎大鼠模型。與對照組相比，病理組大鼠第5天和第7天24h尿蛋白定量顯著升高(p＜0.05)，第10天后24h尿蛋白定量開始下降。
　　2.各病理時(shí)間點(diǎn)Ki67表達(dá)隨病理變化成正關(guān)系。與對照組相比，病理組第7天Ki67表達(dá)量顯著增加(p＜0.05)，并隨病理轉(zhuǎn)歸而下降。細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)與Ki67趨勢相同，在病理最終的第7天表達(dá)量最高(p＜

12、0.05)，隨病理轉(zhuǎn)歸而回到正常。
　　3.Western Blot檢測各病理組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與對照組相比，病理組第7天，cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6的表達(dá)最高(p＜0.05)，而p27kip1表大量最低(p＜0.05)。
　　4.TaqMan Real-time PCR檢測各病理組mIR-34a表達(dá)量變化，結(jié)果表明，與對照組相比，miR-34a表達(dá)與病理變化成負(fù)相關(guān)，

13、病理組第7天表達(dá)量最低(P＜0.05)，隨病理轉(zhuǎn)歸回到正常。
　　5.用siPDGFR-β或siRNA negative control轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞系(RMC)。與對照組相比，siPDGFR-β組增殖活性從48h開始明顯下降(p＜0.05)，至72h更加明顯(p＜0.01)。同時(shí)通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，siPDGFR-β組細(xì)胞周期主要是阻滯在G0/G1期(p＜0.05)（使得G0/G1期延長）;
　　6.用si

14、PDGFR-β或 siRNA negative control轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞系(RMC)，Western Blot檢測對PDGFR-β與p-PDGFR-β的影響。與對照組相比，siPR-β處理組的PDGFR-β、p-PDGFR-β蛋白表達(dá)量明顯下降(P＜0.05)。
　　7.利用siPDGFR-β或siCON轉(zhuǎn)染RMCs，檢測其對RAS/MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的改變。結(jié)果表明，與對照組相比，K-Ras的總蛋白水平下調(diào)(p＜0.

15、05)，Raf1、MEK1、ERK1/2的總蛋白水平不變(p＞0.05)。p-Raf1、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白水平下調(diào)(p＜0.05);
　　8.利用siPDGFR-β或siCON轉(zhuǎn)染RMC后，檢測其對細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE，CDK蛋白CDK2、CDK4、CDK6，CKI蛋白，p27kipI的蛋白影響。結(jié)果表明，siPDGFR-β可以下調(diào)cyclinD1，cyclin E，CDK2，CDK4，CD

16、K6的蛋白水平(p＜0.05），p27kip1表達(dá)量明顯上調(diào)(p＜0.05);
　　9.為驗(yàn)證CDK2或cyclin E是否為miR-34a的靶基因，我們將CDK2/cyclin EmRNA的3'UTR序列克隆至雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒psiCHECKTM-2上。結(jié)果顯示，miR-34a mimics可以下調(diào)RMC細(xì)胞psiCHECK-CDK2/cyclin E的熒光素酶活性(p＜0.05);
　　10.利用miR-34a m

17、imics或者miRNA negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并用20％FBS血清刺激細(xì)胞。結(jié)果表明，從48小時(shí)開始，20％FBS組與20％FBS+Con組增殖能力高于10％FBS組及20％FBS+miR34a組(p＜0.05)，但是10％FBS與20％FBS+miR34a組無差別(p＞0.05);
　　11.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并用20％FBS血清刺

18、激細(xì)胞。結(jié)果表明，在48小時(shí)開始，20％FBS+Con組的細(xì)胞周期G0/G1期與10％FBS組相比明顯縮短(p＜0.05)，而20％FBS+miR34a組的G0/G1期與20％FBS+Con相比明顯延長(p＜0.05)。每次檢測的CV(％)均小于10％，表明結(jié)果可信;
　　12.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并用20％FBS血清刺激細(xì)胞。結(jié)果表明，在刺激48小時(shí)后，與1

19、0％FBS組與20％FBS+miR34a組相比，20％FBS+Con組PDGFR-β與p-PDGFR-β的蛋白表達(dá)明顯增高(p＜0.05)，20％FBS+miR34a組與10％組無差別(p＞0.05);
　　13.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并用20％FBS血清刺激細(xì)胞。結(jié)果表明，在刺激48小時(shí)后，與10％FBS組與20％FBS+miR34a組相比，20％FBS+Co

20、n組的Raf1、ERK1/2的總蛋白無明顯差異(p＞0.05)，K-Ras的總蛋白水平上調(diào)(p＜0.05)。p-Raf1、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白水平上調(diào)(p＜0.05)。與20％FBS+Con組相比，20％FBS+miR34a組的MEK1蛋白明顯降低(p＜0.05);
　　14.利用miR-34a mimics或者miRNA negative control轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，并用20％FBS血清刺激細(xì)胞。我們檢測其對細(xì)胞周期

21、蛋白cyclin D1、cyclinE，CDK蛋白CDK2、CDK4、CDK6，CKI蛋白，p27kip1的蛋白影響。結(jié)果表明，與20％FBS+miR34組相比，20％FBS+Con組的cyclin D1，cyclin E，CDK2， CDK4，CDK6的蛋白水平明顯上調(diào)(p＜0.05)，p27kip1表達(dá)量明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在抗Thy1系膜增殖性腎炎大鼠模型中，miR-34a隨著病理變化而變化

22、，呈負(fù)相關(guān);
　　2.miR-34a可以通過直接作用于靶基因PDGFR-β，進(jìn)而作用于Ras/MAPK信號(hào)通路活性，影響細(xì)胞周期G0/G1期，從而抑制系膜細(xì)胞增殖;
　　3.siPDGFR-β可以通過抑制PDGFR-β而作用于Ras/MAPK信號(hào)通路，延長G0/G1期，從而使RMC細(xì)胞增殖活性下降，此結(jié)果有力證實(shí)miR-34a是通過作用于靶基因PDGFR-β從而影響大鼠系膜細(xì)胞增殖;
　　4.miR-34a可以拮抗外源