miR-34a調(diào)控作用下由miR-181a介導(dǎo)LEF1調(diào)控前列腺癌EMT及侵襲相關(guān)機制的研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：前列腺癌細胞系中與LEF1相關(guān)miRNAs高通量篩選及驗證
　　目的:篩選并驗證與LEF1相關(guān)的miRNAs表達變化。
　　方法:利用3種前列腺癌細胞系LNCaP（LEF1低表達），LNCaP-AI（LEF1高表達）和LNCaP-AIshLEF1（LEF1低表達）做miRNA基因芯片分析。利用TaqMan探針實時定量PCR技術(shù)驗證miRNA基因芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:在miR

2、NA基因芯片所覆蓋的687個 miRNAs中，通過LNCaP-AI/LNCaP和LNCaP-AI/LNCaP-AILEF1shRNA兩組數(shù)據(jù)做聚類分析發(fā)現(xiàn)共有18個miRNAs有超過2倍的表達水平差異，其中LNCaP-AI/LNCaP組中miR-34a表達下調(diào)了6.97倍，而miR-181a上調(diào)了12.36倍。利用TaqMan探針實時定量PCR技術(shù)驗證表達上調(diào)及下調(diào)變化排在前9的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-34a及miR-181a實時定量

3、PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，而且表達變化差異分別位于下調(diào)和上調(diào)中最高。
　　結(jié)論:在前列腺癌細胞系中，miR-34a與LEF1基因表達負相關(guān)，miR-181a與LEF1基因表達正相關(guān)，故選擇miR-34a和miR-181a做進一步研究。
　　第二部分：miR-34a及miR-181a對體外前列腺癌EMT及侵襲功能研究
　　目的:體外實驗探討miR-34a及miR-181a調(diào)控前列腺癌細胞EMT及侵襲功能
　　方

4、法:利用化學(xué)合成的miR-34a或miR-181a模擬物及抑制物模擬過表達或低表達特定microRNA；選擇E-cadherin及N-cadherin作為EMT標志物，Western-blot檢測其蛋白表達水平；BD基質(zhì)膠侵襲實驗及transwell小室檢測侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果:在LNCaP-AI和C4-2B細胞中，miR-34a抑制EMT及侵襲能力，而miR-181a抑制物抑制EMT及侵襲能力；在LNCaP和C4-2B細胞

5、中，miR-34a抑制物促進EMT及侵襲能力，而miR-181a促進EMT及侵襲能力。
　　結(jié)論:前列腺癌中，miR-34a抑制EMT及侵襲能力，miR-181a促進EMT及侵襲能力。
　　第三部分：LEF1與miR-34a及miR-181a作用機制研究
　　目的:探索miR-34a、LEF1和miR-181a三者之間調(diào)控作用關(guān)系
　　方法:TaqMan實時定量PCR及Western-blot檢測基因及蛋白表達水

6、平變化；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-34a特異性結(jié)合LEF13’UTR；利用ChIP方法分析LEF1對miR-181a啟動子區(qū)域調(diào)控作用。
　　結(jié)果:miR-34a通過靶向結(jié)合LEF13’UTR在mRNA水平及蛋白水平負向調(diào)控LEF1，miR-34a在mRNA水平同時負向調(diào)控LEF1及miR-181a。LEF1在轉(zhuǎn)錄水平靶向結(jié)合has-miR-181a-2上游啟動子區(qū)域促進miR-181a表達。
　　結(jié)論:miR-34