下調(diào)著絲粒蛋白E的基因表達(dá)對升高泛素蛋白酶抑制劑lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率的機(jī)制探索.pdf

1、1、目的:
　　探索下調(diào)著絲粒蛋白E引起神經(jīng)元樣分化的PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制,以及與蛋白酶抑制劑協(xié)同作用下介導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的途徑,為研究PD發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　2、方法:
　　運用RNA干擾技術(shù),人工合成下調(diào)CENP-E的shRNA-CENP-E質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(adrenochromaffino,PC12)細(xì)胞株,經(jīng)神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)24小時形成神

2、經(jīng)元樣分化的細(xì)胞。按照以下實驗分組處理細(xì)胞:
　　A組:空白對照組(PC12細(xì)胞);
　　B組:空載體轉(zhuǎn)染組(空載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞);
　　C組:shRNA-CENP-E載體轉(zhuǎn)染組(shRNA-CENP-E載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞組);
　　D組:PD模型組(PC12細(xì)胞+lactacystin組);
　　E組:空載體轉(zhuǎn)染PD模型組(lactacystin+空載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞組);
　　F組:shR

3、NA-CENP-E載體轉(zhuǎn)染PD模型組(lactacystin+shRNA-CENP-E載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞組)。
　　使用熒光定量PCR檢測CENP-E在mRNA水平的表達(dá)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期、蛋白印跡法檢測Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)。
　　3、結(jié)果:
　　1、熒光定量PCR結(jié)果顯示:構(gòu)建的shRNA-CENP-E質(zhì)粒使PC12細(xì)胞中CENP-E mRNA水平較對照組明顯降低(P<0.05),蛋

4、白酶抑制劑誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中CENP-E mRNA表達(dá)也較對照組明顯降低(P<0.05)。
　　2、光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)NGF能使PC12細(xì)胞長出突觸,呈神經(jīng)元樣分化。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)NGF誘導(dǎo)后,大部分PC12細(xì)胞停留于G1期。lactacystin能使經(jīng)NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比例較對照組減少(P<0.05)。
　　3、Western-blot結(jié)果提示下調(diào)CENP-E基因后使PD細(xì)胞模型中Caspa

5、se-9表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05),但對Caspase-8的表達(dá)無明顯影響。
　　4、結(jié)論:
　　1、RNA干擾技術(shù)能下調(diào)PC12細(xì)胞中的著絲粒蛋白E基因。
　　2、神經(jīng)生長因子能使PC12細(xì)胞退出有絲分裂,分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　3、蛋白酶抑制劑lactacystin能使神經(jīng)元樣分化的PC12細(xì)胞重啟細(xì)胞周期。
　　4、在未經(jīng)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中,CENP-E表達(dá)減少導(dǎo)致