Orexin A通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)節(jié)應(yīng)激性高血壓大鼠心血管活動及針刺降壓機制的研究.pdf

1、研究背景:長期、過度的精神緊張和心理應(yīng)激是高血壓的致病因素之一。現(xiàn)代生活節(jié)奏加快和社會競爭激烈使應(yīng)激性高血壓的發(fā)病呈逐年增加和低齡化趨勢。Orexin A(OXA)是1998年發(fā)現(xiàn)的下丘腦神經(jīng)肽，參與對進食行為、能量平衡、睡眠—覺醒周期等多種功能的調(diào)控。OXA免疫陽性神經(jīng)元從下丘腦發(fā)出神經(jīng)纖維投射到延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rVLM)，可能參與對應(yīng)激反應(yīng)和心血管活動的調(diào)控。針刺可降低應(yīng)激性高血壓大鼠的血壓，其機制仍不清楚。
　　目的:本課

2、題通過觀察應(yīng)激性高血壓大鼠(SIHR)和經(jīng)電針治療的應(yīng)激性高血壓大鼠(SIHR+EA)的下丘腦腹外側(cè)—穹隆周圍區(qū)(LH-PFA) OXA免疫陽性神經(jīng)元及rVLM區(qū)OXA特異性受體OX1R的表達變化;以及觀察OX1R與nNOS和iNOS在rVLM區(qū)的共表達及NOS和sGC抑制劑對OXA在rVLM區(qū)引起的心血管效應(yīng)的影響，同時檢測該部位相關(guān)氨基酸遞質(zhì)釋放的改變，探討OXA在rVLM區(qū)可能通過NOS/NO系統(tǒng)，調(diào)節(jié)該部位興奮性和抑制性氨基酸遞

3、質(zhì)的釋放比例，從而對心血管活動進行中樞調(diào)節(jié)，并參與應(yīng)激致高血壓和針刺降壓的中樞機制。
　　方法:以足底電擊結(jié)合噪音刺激建立條件反射為應(yīng)激手段，連續(xù)應(yīng)激14天制備應(yīng)激性高血壓大鼠模型（簡稱應(yīng)激組大鼠）;另有一組大鼠在連續(xù)應(yīng)激10天后，從第11天開始連續(xù)5天，每天加電針足三里穴位處理，制備應(yīng)激性高血壓加電針大鼠模型（簡稱電針組大鼠）;采用免疫組織化學(xué)(IHC)和蛋白免疫印跡法(Western Blot)，觀察應(yīng)激組大鼠和電針組大鼠的L

4、H-PFA區(qū)OXA免疫陽性神經(jīng)元和rVLM區(qū)OX1R表達的變化;采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，觀察rVLM區(qū)OX1R與nNOS或iNOS的共表達情況;采用側(cè)腦室注射的方法觀察OXA對血壓和心率的影響，并用硝酸還原酶法檢測NO代謝產(chǎn)物NOx的含量變化。采用中樞核團微量注射的方法觀察OXA在rVLM區(qū)對血壓和心率的調(diào)節(jié)作用，以及nNOS、iNOS和sGC抑制劑對其效應(yīng)的影響;采用微透析結(jié)合高效液相色譜熒光檢測技術(shù)(HPLC-FD)，觀

5、察上述過程中氨基酸遞質(zhì)釋放的改變。
　　結(jié)果:(1)大鼠經(jīng)連續(xù)14天足底電擊結(jié)合噪音的應(yīng)激處理，動脈收縮壓(SBP)和心率(HR)逐漸升高，應(yīng)激第14天SBP由對照的110±5.4mmHg上升到142±7.6mmHg，HR由對照的372±19beats/min增加到420±23beats/min，與對照組大鼠的SBP和HR相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01，n=20)，說明應(yīng)激性高血壓大鼠模型制備成功。應(yīng)激組大鼠體重增加明顯減緩，應(yīng)激

6、第14天體重為270±14.6g，與對照組大鼠340±16.8g相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01，n=20)。(2)電針組大鼠經(jīng)電針足三里穴處理5天后，SBP和HR逐漸降低而體重增加，第14天SBP為115±9mmHg，HR為385±20beats/min，體重為297±13.3g與應(yīng)激組大鼠的SBP、HR和體重相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01/0.05，n=20)，說明電針對應(yīng)激性高血壓的治療效果確切。(3) IHC結(jié)果顯示，與對照組

7、大鼠相比，應(yīng)激組大鼠LH-PFA區(qū)OXA免疫陽性神經(jīng)元表達明顯上調(diào)，相對光密度值和神經(jīng)元計數(shù)明顯增加(p＜0.01，n=6)。經(jīng)電針處理后，OXA免疫陽性神經(jīng)元表達下調(diào)，相對光密度值和神經(jīng)元計數(shù)均減少(p＜0.05，n=6)。(4) Western Blot結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，應(yīng)激組大鼠rVLM區(qū)OX1R的表達明顯上調(diào)(p＜0.01，n=4)，經(jīng)電針足三里穴處理后的電針組OX1R表達雖與應(yīng)激組大鼠相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但有下降的趨勢

8、。(5)激光共聚焦結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)結(jié)果顯示，rVLM區(qū)OX1R與nNOS或iNOS均有共表達，主要存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。OX1R與nNOS的共表達較與iNOS的多。OX1R在rVLM區(qū)神經(jīng)元上有表達。(6)應(yīng)激組大鼠單側(cè)側(cè)腦室注射OXA（0.01，0.1，1nmol/5μl）后，低劑量（0.01nmol）未觀察到SBP和HR的明顯改變，中、高劑量(0.1，1nmol)能引起SBP和HR呈劑量依賴性升高和加快。單獨注射OX1R的選擇

9、性受體阻斷劑SB-408124對血壓和心率沒有明顯影響。但預(yù)先注射SB-408124再注射OXA，SB-408124可阻斷OXA引起的升壓和加快心率的效應(yīng)。(7)應(yīng)激組大鼠單側(cè)側(cè)腦室分別注射OXA（0.1 nmol，1nmol）、SB-408124(1nmol)或預(yù)先注射SB-408124(1nmol)再5min后注射OXA(1nmol)，20min后檢測rVLM區(qū)NOx的含量，觀察到隨著OXA注射濃度的增加，NOx的含量逐漸降低，單獨

10、注射SB-408124對NOx的含量沒有影響，但SB-408124能阻斷注射OXA引起的NOx的含量下降。(8)正常組大鼠單側(cè)rVLM區(qū)微量注射低劑量OXA(10pmol/0.1μl)，SBP和HR無明顯變化，中、高劑量(50、100pmol) SBP和HR呈劑量依賴性的升高和加快。預(yù)先微量注射nNOS的抑制劑7-Ni(0.05pmol)或sGC的抑制劑Methylene Blue(100pmol)后5min再注射OXA(100pmol

11、)，7-NI和MethyleneBlue可阻斷OXA引起的升壓和加快心率的效應(yīng)。預(yù)先微量注射iNOS的抑制劑AG(10pmol)后5min再注射OXA(100pmol)，對OXA的效應(yīng)沒有明顯影響。應(yīng)激組大鼠單側(cè)rVLM區(qū)微量注射低、中、高劑量OXA均可引起SBP和HR的增加，并呈劑量依賴性。應(yīng)激組大鼠單側(cè)rVLM區(qū)微量注射SB-408124可引起SBP和HR的降低，預(yù)先分別微量注射SB-408124、7-Ni或Methylene Bl

12、ue再注射OXA，均可阻斷OXA的升壓和加快心率的效應(yīng)，預(yù)先注射AG再注射OXA，對OXA的效應(yīng)影響不大。電針組大鼠單側(cè)rVLM區(qū)微量注射各藥物后，引起的效應(yīng)與在正常組大鼠注射引起效應(yīng)基本一致。(9)應(yīng)激組大鼠單側(cè)rVLM區(qū)微量注射OXA(100pmol)、或預(yù)先分別注射7-Ni(0.05pmol)、Methylene Blue(100pmol)、AG(10pmol)再注射OXA，并于注射前10min，注射后第一個10min，第二個10

13、min和第六個10min，rVLM區(qū)微透析出腦脊液用HPLC的方法檢測氨基酸遞質(zhì)釋放的變化，結(jié)果顯示rVLM區(qū)微量注射OXA后，rVLM區(qū)透析液中興奮性氨基酸Glu的釋放明顯增加，而抑制性氨基酸Tau和GABA的釋放減少。預(yù)先注射7-Ni或Methylene Blue后5min再注射OXA，與單獨注射OXA相比，rVLM區(qū)透析液中Glu釋放明顯減少，Tau稍有增加，GABA變化不明顯。預(yù)先注射AG后5min再注射OXA，與單獨注射OXA

14、相比，上述氨基酸釋放變化不明顯。
　　結(jié)論:(1)應(yīng)激性高血壓大鼠下丘腦內(nèi)OXA免疫陽性神經(jīng)元表達增加，而rVLM區(qū)內(nèi)則其特異性受體OX1R表達增加。(2)在rVLM區(qū)給予OX1R特異性受體阻斷劑可降低應(yīng)激性高血壓大鼠的BP和HR，也可阻斷外源性給予OXA引起的升壓和加快心率效應(yīng)。(3) OXA引起的BP升高和HR加快可能與rVLM區(qū)NO的含量減少有關(guān)。(4)OXA在rVLM區(qū)可能主要通過nNOS/NO-sGC途徑，增加Glu的釋