補(bǔ)腎活血方對(duì)Hpth(1-34)干預(yù)下成骨細(xì)胞的影響及其治療腎性骨病患者的遠(yuǎn)期療效觀察.pdf

1、腎性骨病(ROD)是由慢性腎臟疾病及終末期腎臟疾病引起的體內(nèi)礦物質(zhì)和骨代謝系統(tǒng)紊亂的一組臨床癥候癥，它是慢性腎功能衰竭(CRF)常見(jiàn)、嚴(yán)重、治療困難的并發(fā)癥。當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)率GFR<10ml/min時(shí)，幾乎100％的CRF患者都會(huì)發(fā)生ROD。
　　高轉(zhuǎn)運(yùn)腎性骨病是三種腎性骨病中最常見(jiàn)的骨病類(lèi)型。高轉(zhuǎn)換型腎性骨病的主要原因是繼發(fā)性甲旁亢，甲狀旁腺激素(PTH)分泌亢進(jìn)，過(guò)量的PTH使骨重建過(guò)程的吸收和生成兩種功能均亢進(jìn)，成骨、破骨細(xì)胞

2、異常增生活躍，而當(dāng)破骨細(xì)胞增生大于成骨細(xì)胞，最終骨吸收大于骨形成，形成骨病。而成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間信息交流的分子基礎(chǔ)是成骨細(xì)胞表達(dá)的骨保護(hù)素(OPG)及其配體(RANKL)和破骨細(xì)胞表達(dá)的NF-kB的活化受體(RANK)，即OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)，PTH對(duì)其有調(diào)控作用。
　　目前西醫(yī)對(duì)ROD主要采取對(duì)癥治療，包括飲食治療、磷結(jié)合劑、活性維生素D類(lèi)似物的應(yīng)用、合理調(diào)整血鈣、磷、iPTH水平、鈣敏感受體激動(dòng)劑的應(yīng)用及透析方

3、式的調(diào)整，雖能部分改善腎性骨病患者的臨床癥狀，但臨床遠(yuǎn)期療效并不理想，可能導(dǎo)致軟組織異位鈣化，引發(fā)心腦血管并發(fā)癥發(fā)生率增加，且存在藥物價(jià)格昂貴等多個(gè)問(wèn)題。中醫(yī)從“腎主骨”理論出發(fā)，根據(jù)腎性骨病脾腎衰憊為本、濁瘀內(nèi)阻為標(biāo)的基本病機(jī)，以補(bǔ)腎活血為大法，自擬補(bǔ)腎活血方(主要組成：熟地、川斷、狗脊、補(bǔ)骨脂、丹參、大黃、當(dāng)歸)治療腎性骨病。以期通過(guò)調(diào)節(jié)骨代謝平衡，改善甲旁亢作用，發(fā)揮其治療作用。
　　1、研究目的：
　　本課題研究分為

4、實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究?jī)刹糠帧?br>　　實(shí)驗(yàn)研究目的在于通過(guò)體外模擬腎性骨病繼發(fā)性甲旁亢狀態(tài)，以人類(lèi)重組甲狀旁腺激素(hPTH)干預(yù)的小鼠成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察補(bǔ)。腎活血含藥血清對(duì)其增殖、分化的影響及其對(duì)OPG及RANKL基因表達(dá)的影響，以探討補(bǔ)腎活血中藥治療腎性骨病的分子水平機(jī)制。
　　臨床研究則以隨訪形式追蹤觀察曾經(jīng)入組的服用補(bǔ)腎活血顆粒腎性骨病患者，從心血管并發(fā)癥、終點(diǎn)事件、骨代謝水平、生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況方面評(píng)定補(bǔ)腎活血方的

5、遠(yuǎn)期臨床療效，更為臨床采用中醫(yī)藥治療腎性骨病提供相對(duì)客觀評(píng)價(jià)依據(jù)。
　　2、研究方法：
　　2.1實(shí)驗(yàn)方法
　?、倥囵B(yǎng)成骨細(xì)胞MC3T3-E1，配制終濃度為10ng/ml的hPTH(1-34)溶液作為體外模擬甲旁亢的干預(yù)條件，制備中藥、西藥及正常鼠含藥血清，實(shí)驗(yàn)分組。
　?、谟肕TT法在細(xì)胞培養(yǎng)的24h、48h、72h分別檢測(cè)不同濃度補(bǔ)腎活血方組對(duì)hPTH(1-34)干預(yù)下MC3T3-E1增殖的作用。
　　

6、③用ELISA方法在細(xì)胞培養(yǎng)的24h、48h、72h分別檢測(cè)不同濃度補(bǔ)腎活血含藥血清組細(xì)胞在hPTH(1-34)干預(yù)下其上清液中PICP和ALP分泌水平。
　　④采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在8h、12h、24h時(shí)，對(duì)PTH干預(yù)下的的小鼠成骨細(xì)胞的OPGmRNA、RANKLmRNA的表達(dá)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。
　　2.2臨床研究方法
　　本研究以2008年10月～2009年3月期間曾經(jīng)參與“補(bǔ)腎活血法改善腎性骨病病人生存質(zhì)量及

7、骨代謝異常臨床研究”課題的維持性血液透析腎性骨病患者為研究對(duì)象，治療組及對(duì)照組則根據(jù)當(dāng)時(shí)是否接受中藥干預(yù)治療劃分，其中對(duì)照組采取規(guī)律活血顆粒。采用病例對(duì)照研究的血透、常規(guī)補(bǔ)鈣降磷等基本治療，而治療組則是在基本治療基礎(chǔ)上加以口服補(bǔ)腎方法，追蹤觀察兩組患者3年。臨床觀察指標(biāo)主要包含兩部分，一為回顧性記錄3年中骨化三醇沖擊治療次數(shù)、心腦血管發(fā)生率、一年及三年生存率、終點(diǎn)事件發(fā)生率；另一為評(píng)估在3年觀察終位時(shí)間點(diǎn)時(shí)生存質(zhì)量評(píng)分、營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)分，甲

8、狀旁腺激素水平、鈣、磷等骨代謝指標(biāo)、腎功能指標(biāo)、鈣、磷及鈣磷乘積達(dá)標(biāo)率，將兩組觀察指標(biāo)進(jìn)行比較。所得數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)，描述性計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。
　　3、結(jié)果：
　　3.1實(shí)驗(yàn)研究部分
　　3.1.1各組細(xì)胞增殖水平的比較：隨時(shí)間增加，中藥各濃度組細(xì)胞增殖水平明顯上升，而模型PTH組則從48h增殖率開(kāi)始下降，當(dāng)達(dá)到72h時(shí)，模型P

9、TH組OD值明顯低于正常組(P<0.05)，而各濃度中藥組細(xì)胞增殖水平均顯著高于模型PTH組(P<0.01)，且增殖水平呈劑量依賴(lài)性，即濃度越高增殖水平也越高。
　　3.1.2各組ALP、PICP分泌量的比較：①自48h始至72h，各濃度中藥含藥血清組ALP分泌量均顯著高于模型PTH組(P<0.01)；②而中藥高濃度組在72h時(shí)PICP分泌量顯著高于模型PTH組(P<0.01)。
　　3.1.3各組OPGmRNA及RANKL

10、mRNA表達(dá)水平的比較：①在經(jīng)一定濃度(10ng/ml)的PTH持續(xù)刺激后，成骨細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)先是出現(xiàn)略微增高趨勢(shì)，之后開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)抑制，至24h時(shí)OPGmRNA表達(dá)明顯抑制，表達(dá)量與正常組相比顯著減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；另一方面，隨時(shí)間延長(zhǎng)RANKL表達(dá)量則呈不斷上升趨勢(shì)，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較正常組RANKL水平明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)，表明PTH能明顯上調(diào)RANKLmRNA的表達(dá)；②補(bǔ)腎活血各濃度組及西

11、藥骨化三醇組隨時(shí)間延長(zhǎng)，OPGmRNA水平逐漸升高，促進(jìn)其表達(dá)，至24h時(shí)達(dá)到高峰；且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較模型PTH組OPGmRNA水平增高，中藥組呈劑量依賴(lài)性，即補(bǔ)腎活血含藥血清濃度越高，OPGmRNA表達(dá)量也越高；③補(bǔ)腎活血各濃度組及西藥骨化三醇組RANKL表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，但從12h起，各組RANKL表達(dá)量均較模型組減低，且差異有顯著性(P<0.01)，至24h時(shí)，各組RANKL表達(dá)量仍較模型組低，且P<0.05，有顯著性差異

12、。中藥各濃度組中，高濃度組RANKL表達(dá)量最低，中濃度組次之，低濃度組最高。西藥骨化三醇在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)RANKL表達(dá)量則與補(bǔ)腎活血中濃度組近似。
　　3.2臨床研究部分
　　3.2.1骨化三醇沖擊治療率：治療組骨化三醇沖擊治療率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，但治療組運(yùn)用骨化三醇沖擊治療的頻次與對(duì)照組總體無(wú)顯著性差異。
　　3.2.2心血管并發(fā)癥發(fā)生率：兩組的心梗、腦梗、心絞痛及心律失常發(fā)生率雖無(wú)顯著性差異(P>0.05

13、)，但治療組急性心衰發(fā)生率明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，且心絞痛發(fā)生頻次也明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)。
　　3.2.3終點(diǎn)事件：兩組骨折發(fā)生率均較低，兩組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間一年生存率相比無(wú)顯著性差異，而三年生存率則有顯著性差異，治療組優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)；兩組患者的死亡原因主要為心腦血管疾病和感染。
　　3.2.4骨代謝指標(biāo)：治療組iPTH、血磷水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.

14、05)，血鈣水平兩組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；治療組鈣磷乘積達(dá)標(biāo)率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，結(jié)果有顯著性差異。
　　3.2.5腎功能指標(biāo)：兩組血肌酐及尿素氮水平相比，P均>0.05，無(wú)顯著性差異。
　　3.2.6生存質(zhì)量：①八個(gè)維度比較：治療組在生理機(jī)能(PF)和總體健康(GH)得分高于對(duì)照組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明治療組在生理機(jī)能(PF)和總體健康(GH)方面優(yōu)于對(duì)照組；而生理職能(RP)、軀

15、體疼痛(BP)得分與對(duì)照組相比則無(wú)顯著性差異；治療組一般精力(VT)和精神健康(MH)方面得分均高于對(duì)照組(P<0.01)，有極顯著性差異，表明治療組患者一般精力及精神健康方面均明顯優(yōu)于對(duì)照組；而治療組在社會(huì)功能(SF)及情感職能(RE)方面，評(píng)分也均高于對(duì)照組(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，治療組患者社會(huì)功能和情感職能也較對(duì)照組好。②在生理健康(PCS)總得分方面，治療組評(píng)分高于對(duì)照組，P<0.01，有極顯著性差異，說(shuō)明治療組生理健康

16、優(yōu)于對(duì)照組；而治療組心理健康總得分(MCS)高于對(duì)照組，P<0.01，有極顯著性差異，治療組心理健康也優(yōu)于對(duì)照組。③治療組SF-36總分高于對(duì)照組，P<0.05，有顯著性差異。
　　3.2.7營(yíng)養(yǎng)狀況：治療組存在營(yíng)養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)人數(shù)12人(25.5％)，而對(duì)照組則有20人(47.6％)，兩組相比，治療組存在營(yíng)養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)人數(shù)比低于對(duì)照組，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明治療組患者營(yíng)養(yǎng)狀況較對(duì)照組好。
　　4、結(jié)論：
　　4.1補(bǔ)腎活

17、血方含藥血清能改善甲旁亢作用下成骨細(xì)胞的骨代謝作用，在促進(jìn)hPTH(1-34)干預(yù)下小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖的同時(shí)，也能很好地促進(jìn)其進(jìn)一步分化成熟，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成，且促進(jìn)效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性。
　　4.2補(bǔ)腎活血方含藥血清能上調(diào)PTH干預(yù)下OPGmRNA的表達(dá)，降低PTH干預(yù)下RANKLmRNA的高表達(dá)，提示補(bǔ)腎活血方可能通過(guò)很好地促進(jìn)骨形成，抑制甲旁亢引起的過(guò)度骨吸收作用機(jī)制來(lái)改善骨代謝平衡。并且中藥濃度越高，促進(jìn)骨

18、形成作用越明顯，反之，中藥濃度越高抑制骨吸收作用也最強(qiáng)。補(bǔ)腎活血方組在體外調(diào)整骨代謝作用與西藥骨化三醇相近。
　　4.3補(bǔ)腎活血方能減少骨化三醇沖擊治療率，降低iPTH、高血磷水平，提高鈣磷乘積達(dá)標(biāo)率，并能改善ROD患者生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況，減少心血管并發(fā)癥發(fā)生率，提高生存率，提示補(bǔ)腎活血方治療腎性骨病患者遠(yuǎn)期療效好。
　　5、創(chuàng)新點(diǎn)：
　　5.1關(guān)于腎性骨病實(shí)驗(yàn)研究模型的造模方法多采用大鼠部分腎切除加高磷飲食，本課題實(shí)

19、驗(yàn)研究則從微觀入手，采用直接給予小鼠成骨細(xì)胞一定濃度PTH持續(xù)刺激的方法進(jìn)行造模，在體外模擬甲旁亢狀態(tài)，此造模方法國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道；
　　5.2觀察補(bǔ)腎活血方能改善PTH干預(yù)下的OPG及RANKLmRNA的表達(dá)，從細(xì)胞分子生物學(xué)水平上評(píng)價(jià)補(bǔ)腎活血方促進(jìn)骨形成，抑制過(guò)度骨吸收，改善骨代謝的作用；
　　5.3采用了目前最前沿的實(shí)驗(yàn)方法Realtime-PCR法檢測(cè)小鼠成骨細(xì)胞中OPGmRNA及RANKLmRNA表達(dá)量，較以往普