腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在條件性味覺厭惡記憶再整合過程中腦區(qū)特異性作用的研究.pdf

1、一、研究目的:在學(xué)習(xí)記憶的過程中,新的牢固記憶的形成有賴于學(xué)習(xí)后短時記憶向長時記憶過渡的一段穩(wěn)定的過程,此過程稱之為“整合”(consolidation)。然而當與先前的記憶相同或是相似條件刺激(conditioned stimulus,CS)再次出現(xiàn)時,經(jīng)過整合后的記憶會被再次激活,并進入一過性不穩(wěn)定的狀態(tài),這一過程稱之為“再整合”(reconsolidation)。當記憶進入再整合過程后,根據(jù)條件的不同結(jié)局也會不同:如果再次出現(xiàn)相同

2、的非條件刺激(unconditioned stimulus,US),則使原有記憶更加穩(wěn)定；如果沒有出現(xiàn)US,則可能進入消退過程,表現(xiàn)為原有記憶強度的減弱,因此,再整合在長時記憶形成的生理過程中至關(guān)重要。隨著研究的深入,再整合過程的研究已經(jīng)大幅擴展到眾多學(xué)習(xí)記憶的系統(tǒng)模型和流程中,并發(fā)現(xiàn)了不同于其他記憶過程的特點:首先,再整合中涉及的神經(jīng)環(huán)路及分子與整合過程有所不同；其次,阻斷再整合并不能讓記憶轉(zhuǎn)向消退過程；再次,再整合的機制傾向于信息更

3、新說,如果新信息與原有記憶獲得時的信息不同,則會導(dǎo)致以前整合的記憶發(fā)生改變；最后,再整合在一定條件下才能被干預(yù)。這些特有的性質(zhì)決定了再整合過程的特殊性。了解參與該過程的分子機制對深入認識再整合的本質(zhì),為將來進行相關(guān)臨床記憶障礙疾病的有效干預(yù)提供借鑒。
　　 在學(xué)習(xí)記憶的研究中,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophicfactor,BDNF)是其中的重要分子之一,它不僅可以維持胚胎期神經(jīng)元的存活和分

4、化、突起生長、聯(lián)系和可塑性,而且進一步的證據(jù)表明,BDNF也參與了其他多項高級神經(jīng)功能,如認知、情緒、精神、思維、學(xué)習(xí)記憶等。BDNF能夠與在神經(jīng)細胞上高親和力的酪氨酸蛋白激酶B(Tyrosine kinase,TrkB)受體特異性結(jié)合,激發(fā)各種信號傳導(dǎo)通路而發(fā)揮其特殊的生物作用。目前的研究表明,BDNF參與了多種記憶的調(diào)控,并在不同腦區(qū)不同過程發(fā)揮不同作用:在海馬學(xué)習(xí)記憶研究中,Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)成年BDNF基因缺失突變小鼠空

5、間記憶的獲得明顯減弱；在條件性位置偏好實驗中,BDNF通過促進長時程增強(long-termpotentiation,LTP),對記憶的整合作用起重要作用；另有文獻證實海馬中BDNF表達在環(huán)境依賴性恐懼記憶中的獲得,整合中發(fā)揮作用,而阻斷海馬BDNF功能則可能妨礙已獲得記憶的消退。而杏仁體中央核(central nuclei of amygdala,CeA)及杏仁體基底外側(cè)核(basolateral nuclei of amygdala

6、,BLA)在條件性恐懼記憶的獲得,整合及消退過程中的作用不同,阻斷CeA腦區(qū)BDNF合成可以抑制恐懼記憶的獲得及整合。此外,有資料顯示BDNF通過前額葉(prefrontal cortex,PFC)及其亞核團(緣前葉,邊緣前皮質(zhì))在條件性恐懼記憶的整合,消退的調(diào)控中發(fā)揮不同作用。上述研究表明,BDNF廣泛參與了各種學(xué)習(xí)記憶模型,并且在不同腦區(qū)調(diào)控記憶的不同過程,發(fā)揮重要作用；但是BDNF在再整合過程中是否發(fā)揮作用,有無時空作用的特異性尚

7、不清楚。
　　 條件性味覺厭惡(conditioned taste aversion,CTA)是厭惡性聯(lián)合學(xué)習(xí)模型的一種,是通過將一種新奇味覺刺激與腹部不適感相偶聯(lián)而獲得記憶的模型。這一模型有較多優(yōu)點,它可以通過一次學(xué)習(xí)獲得,并且記憶保持時間長久,操作相對簡單,所以是研究厭惡性聯(lián)合學(xué)習(xí)記憶的較好模型。已有的報道證實,在CTA模型中,阻斷大鼠島葉皮層(insular cortex,IC)的蛋白合成能夠影響記憶的整合及再整合過程,而

8、且有文獻證明阻斷杏仁體腦區(qū)新蛋白合成后,對CTA記憶的再整合過程并無影響,但是BDNF是在其中變化情況及作用尚不明確。所以本項研究主要通過CTA模型的建立,利用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)及腦立體定位顯微注射等方法,檢測再整合過程中BDNF在不同腦區(qū)的表達水平,比較與整合過程的差異,并在上述過程中施加干預(yù)因素,觀察其行為學(xué)表現(xiàn)。
　　 二、研究方法

9、:
　　 1.在基因表達水平明確BDNF在CTA再整合過程中的變化:大鼠經(jīng)過CTA再整合的訓(xùn)練,在不同時間點(第一天測試后2 h,4 h,6 h,8 h及12h)取材,提取IC及CeA腦區(qū)的組織利用RT-PCR的方法,檢測BDNF mRNA表達水平的變化,并在變化最明顯的時間點的比較各組BDNF mRNA表達情況。
　　 2.證實BDNF對CTA行為學(xué)的影響:利用腦內(nèi)微量注射抑制劑K252a阻斷Trk受體,來確定IC及C

10、eA BDNF功能阻斷后,對CTA整合及再整合過程中厭惡指數(shù)(aversion index,AI)的影響；并同時監(jiān)測注射K252a后,相應(yīng)腦區(qū)BDNF mRNA的變化情況。由于K252a非選擇性作用于Trk受體,為進一步驗證BDNF／TrkB通路作用的特異性,分別在CTA整合和再整合過程中,IC內(nèi)給與BDNF的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO),并檢測行為學(xué)變化。
　　 3.給予外源性人工

11、重組BDNF(human recombinant BDNF,hrBDNF)特異性糾正BDNF ASO引發(fā)的記憶缺陷:分別在CTA整合和再整合過程中,IC內(nèi)微量注射ASO并注射hrBDNF對ASO阻斷BDNF合成產(chǎn)生的行為學(xué)影響進行補救,從而證明BDNF在整合及再整合中作用的特異性。
　　 三、實驗結(jié)果:
　　 1.RT-PCR結(jié)果顯示IC的BDNF mRNA水平分別在CTA再整合后6小時及整合后4小時達到高峰,與對照組相

12、比有顯著性差異；CeA的BDNF mRNA表達在整合后4小時變化與對照組相比顯著性升高,但是,再整合后6小時其表達無明顯變化。
　　 2.給與K252a后,在IC中再整合及整合過程與對照組相比均發(fā)生明顯行為學(xué)改變；但是在CeA腦區(qū)僅在整合過程中發(fā)生行為學(xué)的明顯改變；而在BDNF表達水平上,注射K252a后取材,檢測并發(fā)現(xiàn)IC內(nèi)BDNF mRNA水平在再整合及整合過程中與空白對照組相比均無差異,CeA腦區(qū)其水平在兩個過程中與對照組

13、相比也無明顯差異。選擇IC進一步給與BDNF ASO后,其行為學(xué)變化與注射K252a后相似。
　　 3.選擇IC給與BDNF ASO后,后再予以外源性hrBDNF可以糾正行為學(xué)的缺陷。
　　 四、買驗緒論:
　　 通過從分子到整體不同水平的實驗,我們證實BDNF參與了CTA記憶的再整合過程,并在IC及CeA中的作用存在差異;BDNF在CTA整合及再整合過程中的作用也存在不同。以上時、空、記憶過程中BDNF作用的差