結(jié)核分枝桿菌中dodecin-like家族蛋白的初步研究與結(jié)核抗體檢測試劑盒的研制和應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是一種古老的傳染性疾病,但目前對于其病原微生物結(jié)核分枝桿菌的研究還不是很透徹。結(jié)核分枝桿菌的4000多個基因中,只有40％左右的編碼基因功能明確,其余基因的功能都不十分清楚。
　　 我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中存在一種特殊的黃素結(jié)合蛋白(dodecin),編碼基因?yàn)镽v1498A,共70個氨基酸,以十二聚體的形式存在,屬于dodecin-like蛋白家族。目前發(fā)現(xiàn)dodecin蛋白基本上存在于極端微生物中,能夠儲存和運(yùn)輸黃素(包

2、括FMN和FAD),在微生物的氧化還原反應(yīng)(如電子傳遞鏈)和某些新陳代謝過程中起著重要的作用。我們通過質(zhì)譜、光譜學(xué)、分子進(jìn)化分析和等溫滴定微量熱分析等方面的研究與分析,證實(shí)Rv1498A在體內(nèi)體外都能夠與黃素結(jié)合,且與FMN的結(jié)合能力高于FAD。
　　 對Rv1498A蛋白的理化性質(zhì)分析表明,該蛋白能夠耐受5M NaCl(接近飽和的鹽濃度)和121℃高溫處理等極端環(huán)境的破壞。經(jīng)DSC分析表明,使該蛋白完全變性的溫度需要超過130

3、℃。
　　 通過對Rv1498A蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析與分析,我們證實(shí)蛋白質(zhì)在極端環(huán)境中的穩(wěn)定性與表面電荷的多少沒有關(guān)系,而是鹽鍵網(wǎng)絡(luò)、氫鍵網(wǎng)絡(luò)、表面離子結(jié)一合和疏水殘基埋藏等因素綜合作用的結(jié)果。Rv1498A形成一個對稱的四面體狀中空結(jié)構(gòu),可以將蛋白或多肽展示在十二聚體的外表面,實(shí)現(xiàn)被展示蛋白的對稱性多聚化,從而提高蛋白的活性;也可以將藥物或生物活性化合物包埋在蛋白內(nèi)部,為研制新型的藥物投遞系統(tǒng)和常溫疫苗等奠定基礎(chǔ)。
　　

4、 在對dodecin-like蛋白家族的分子進(jìn)化分析研究中,發(fā)現(xiàn)該家族隨著物種進(jìn)化的過程,其蛋白功能由嗜鹽古細(xì)菌的黃素結(jié)合開始,產(chǎn)生兩種方向上的進(jìn)化(直系同源和旁系同源),一個方向仍然結(jié)合黃素,另一個方向的功能尚不明確。在包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的7種極端微生物中,同時存在2個dodecin-like蛋白家族的成員。我們針對結(jié)核分枝桿菌中另一個dodicin-like家族蛋白mtb8的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能等的研究和分析表明,該蛋白為鹽依賴性

5、蛋白,能耐受5M NaCl的高鹽,并在鹽離子(尤其是多價離子)的幫助下,可以耐受高壓滅菌及高濃度乙醇溶液的破壞。Mtb8在鹽離子的作用下形成十二聚體,但不結(jié)合黃素,通過結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子進(jìn)化分析、分析超離和光譜學(xué)分析等方式的研究證實(shí),mtb8擁有與Rv1498A相似的結(jié)構(gòu)但執(zhí)行的功能不一致。
　　 另外,我們在對結(jié)核分枝桿菌來源的其它基因工程重組抗原的理化性質(zhì)研究中,發(fā)現(xiàn)很多表達(dá)在超聲上清或包涵體復(fù)性后擁有接近天然構(gòu)象的蛋白,也能夠

6、承受100℃的高溫變性處理,證實(shí)極端微生物來源的蛋白質(zhì)往往都具有耐受極端環(huán)境破壞的能力。這為今后基因工程重組抗原的表達(dá)純化提供了一個良好的思路。
　　 目前,結(jié)核分枝桿菌的感染情況很嚴(yán)重,全球約有三分之一的人群感染結(jié)核,且每年約有800-1000萬新發(fā)結(jié)核病患者,約有300萬人死于結(jié)核病,我國在全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中排名第二。然而結(jié)核病的現(xiàn)有診斷方式都存在各種缺陷和不足,其中血清學(xué)診斷試劑,尤其是國產(chǎn)試劑,質(zhì)量需要盡快提高。