胃癌中Fascin基因的表達及與進展期胃癌預后相關(guān)的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、第一部分 Fascin基因在胃癌中的表達及其意義 目的：Fascin蛋白代表一類肌動蛋白結(jié)合蛋白家族，其蛋白質(zhì)編碼的產(chǎn)物是一種細胞骨架蛋白。這種蛋白可以與F-肌動蛋白相結(jié)合，定位于細胞質(zhì)張力纖維和細胞膜皺褶（ruffles）邊緣的絲狀偽足、微棘（microspikes）等細胞突起的核心肌動蛋白束，通過與F-肌動蛋白的結(jié)合，可以完成細胞的附著和運動。這種結(jié)構(gòu)的形成受細胞細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)信號的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在正常人上皮細胞中，在

2、食道鱗狀上皮基底層和表皮基底層中均有表達，而在其他的上皮組織沒有表達。在對于腫瘤組織上皮研究中發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥上皮細胞中，F(xiàn)ascin呈陽性表達，且在部分腫瘤中與腫瘤的預后有一定關(guān)系。在對于Fascin在消化道腫瘤中表達的研究，目前報道較少。本實驗通過免疫組化方法研究Fascin蛋白在249例胃癌病人腫瘤細胞中的表達，結(jié)合腫瘤病人的臨床病理學特征，綜合分析不同類型腫瘤細胞的臨床病理特征與Fascin表達之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)Fascin在

3、胃癌中的表達及與預后的關(guān)系。 研究方法：采用免疫組織化學方法對北京大學臨床腫瘤醫(yī)院自1996～2001年間手術(shù)切除的胃癌手術(shù)標本249例行Fascin免疫組化染色，研究Fascin在胃癌病人的表達。同時收集這些病例的臨床資料，包括病人的年齡、性別、胃癌的分期、腫瘤的TNM分期、腫瘤細胞的分化。對病人的術(shù)后生存進行隨訪觀察。通過統(tǒng)計學軟件SSPS13.0，分析所得到的臨床病理數(shù)據(jù)和Fascin的表達水平的關(guān)系。 結(jié)果：24

4、9例病人中，55例病人腫瘤細胞呈陽性表達（22.1％），其中37例表達為“1+”（14.9％），18例病人腫瘤細胞表達為“2+”（7.2％）。通過對Fascin的表達與臨床病理學資料的研究，我們發(fā)現(xiàn)Fascin的表達與病人的年齡（p=0.032）、胃癌細胞的分化程度相關(guān)，其中，在高分化的胃癌腫瘤細胞中，F(xiàn)ascin的表達與低分化的腫瘤細胞相比較有顯著性差異（p=0.001）。而在性別、腫瘤的T、N、M分期方面，F(xiàn)ascin的表達無明顯差

5、異。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在Fascin表達呈強陽性（2+）的病人中，其預后要明顯差于陰性表達的病人。 結(jié)論: 1.Fascin在正常胃腺上皮中無表達，在胃癌中有表達，胃癌中Fascin的表達，提示胃癌細胞的運動骨架發(fā)生改變。 2.Fascin在分化不同的胃癌中表達有差異，提示胃癌的分化與其表達強度不同與存在一定關(guān)系。 3.Fascin在胃癌病人中的高表達提示預后不良。 第二部分與進展期胃癌預后相關(guān)的蛋

6、白組學研究 研究目的:胃癌是危害我國人類健康的常見惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重威脅人類的生命和健康。雖然早期胃癌治療目前的五年生存率可以達到85％以上，但在我國這部分病人的比例僅僅占到10％-30％。在就診的胃癌病例中，絕大部分為進展期胃癌，其整體治療效果不好，預后差異較大。因此術(shù)前通過尋找合適的腫瘤標志物，對于術(shù)前準確的病理分期（TNM）、提供針對性措施的治療、判斷進展期胃癌病人的預后等方面有深遠的意義。

7、腫瘤標志物，是惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成、分泌的，或因機體對腫瘤反應而異常產(chǎn)生的、反應腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，是檢測、診斷、治療、監(jiān)測腫瘤和判斷腫瘤預后的重要標志。目前臨床上常用的胃癌腫瘤標志物有CEA，CA19-9等，由于缺乏一定的特異性和敏感性，主要用于胃癌病人的初篩和治療后的復發(fā)監(jiān)測。目前臨床工作中，缺少反映進展期胃癌預后相關(guān)的腫瘤標志物。 蛋白組學（protemics）是以蛋白質(zhì)組為研究對象，

8、分析細胞內(nèi)動態(tài)變化蛋白質(zhì)的組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動規(guī)律。同時質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展和二維電泳技術(shù)的不斷進步，為蛋白質(zhì)組研究進行高靈敏度、高速鑒定提供了有力支持，為分析體液中各種復雜蛋白質(zhì)成分提供了可能。用蛋白質(zhì)組學來研究腫瘤，有利于篩選腫瘤標志蛋白，判斷腫瘤的預后，確定腫瘤治療靶標，尋找新的腫瘤特異抗原。 通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究不同預后的進展期胃癌病人之間

9、蛋白表達的差異，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)一系列的反應不同預后的進展期胃癌病人的蛋白表達，通過這些蛋白質(zhì)的篩選和進一步研究，以期發(fā)現(xiàn)能夠反應進展期胃癌病人預后的腫瘤標志物，通過這些標志物，可以對胃癌的分期做出準確判斷，可以推測胃癌病人的預后，以及尋找胃癌藥物靶向治療的新思路。 研究方法:為了鑒定與進展期胃癌患者預后相關(guān)的蛋白，我們回顧性選取了預后相差較大的兩組進展期胃癌患者的冰凍組織為研究對象（預后好的一組患者的生存期均>34個月，預后差

10、一組患者的生存期均<15個月）。分別提取兩組的組織蛋白經(jīng)等量混合、胰酶消化過夜后，應用NanoLC-MS/MS（LTQ）（納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，線性離子阱）方法得到兩組差異蛋白的氨基酸序列，數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot服務器及Swiss-prot、NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行了常規(guī)序列相似性分析及蛋白的鑒定。 針對兩組間表達差異較大的基因S100P和HnRNP A2/B1，我們采用了免疫組化方法對93例進展期胃癌病人的標本進行了檢測，

11、同時采用統(tǒng)計學方法對其在胃癌中的表達與臨床病理參數(shù)及患者預后的關(guān)系進行了分析。 研究結(jié)果:應用蛋白質(zhì)組的方法，在預后好的組中共鑒別出284個蛋白，在預后差的組中鑒別出213個蛋白，其中，130個蛋白只在預后好的一組被識別，58個蛋白只在預后差的一組被識別。其中在兩組間均鑒別出且差異大于3倍的有14個，大于兩倍的有28個。對于兩組中分別鑒別出的蛋白，應用WEGO在線工具，對其基因功能進行了分類，這些蛋白涉及鈣離子的信號傳導、細胞代

12、謝、應激反應、細胞骨架蛋白等等，為進一步尋找可以預測進展期胃癌預后的腫瘤標志物奠定了基礎(chǔ)。這些蛋白中，有些已經(jīng)被文獻證實與胃癌的預后或轉(zhuǎn)移等相關(guān)。 通過對16例預后不同的進展期胃癌病人的臨床病理學資料進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，在不同預后的進展期胃癌病人中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在N1和超過N1轉(zhuǎn)移的兩組中，其差異具有顯著性。我們期望通過差異蛋白組學的研究，篩選出能夠預測進展期胃癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的腫瘤標志物，針對兩組間表達差異較大的基因S1

13、00P和HnRNP A2/B1，我們采用了免疫組化方法進行了檢測，同時對其在胃癌中的表達與臨床病理參數(shù)及患者預后的關(guān)系進行了描述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100P在正常胃粘膜中表達較高，在胃癌中的表達下降，在本組的93例病例中其陽性表達率為47.3％，并且其在胃癌中的高表達與患者的預后相關(guān)（P=0.0375），S100P在胃癌中的高表達與原發(fā)腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)（P＝0.006，P=0.006）。研究表明，免疫組化和蛋白質(zhì)組學的分析鑒

14、定結(jié)果是一致的，S100P可以用來作為判斷進展期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后的腫瘤標志物。而在HnRNPA2/B1的免疫組化中發(fā)現(xiàn)，其在胃癌組織中的表達為92.6％，而在癌旁的非腫瘤組織中，也發(fā)現(xiàn)了其陽性表達，統(tǒng)計學分析，HnRNP A2/B1的表達與病人的臨床病理學資料中差異無顯著性意義，表明其并不適合作為判斷進展期胃癌預后的腫瘤標志物。 結(jié)論: 1.應用蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，可以在不同預后的進展期胃癌病人篩選出差異表達的蛋白

15、，這些蛋白涉及鈣離子的信號傳導、細胞代謝、應激反應、細胞骨架蛋白等等，可以為鑒定胃癌病人的分期、預后相關(guān)的腫瘤標志物研究提供基礎(chǔ)。 2.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（超過第一站的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）是影響進展期胃癌病人預后的一個關(guān)鍵因素。 3.S100P可以反應進展期胃癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，從而可以作為腫瘤標志物用來判斷進展期胃癌病人的預后。 4.HnRNP A2/B1不適合用于判斷進展期胃癌預后的腫瘤標志物。 5.進展期胃