重組腺相關(guān)病毒-人凝血因子Ⅸ基因無創(chuàng)途徑基因治療血友病B的安全性研究.pdf

1、血友病B是一種FIX基因缺陷所致的X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，基因治療是唯一能治愈此病的方法。目前世界上主要給藥方式均為有創(chuàng)，而以腸上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過灌腸給藥，則避免了有創(chuàng)的治療方式。本實驗室前期實驗已經(jīng)證實，重組腺相關(guān)病毒載體／人凝血因子IX(rAAV2／hFIX)可體外轉(zhuǎn)染腸上皮細(xì)胞并能夠表達(dá)具有生理活性的hFIX；同時，體內(nèi)實驗中我們亦證明了rAAV2／hFIX能夠轉(zhuǎn)染腸上皮細(xì)胞并能夠表達(dá)具有生理活性的hFIX。 目的

2、：系統(tǒng)地檢測結(jié)腸灌注rAAV2／hFIX基因治療血友病B的安全性，為進(jìn)一步的臨床實驗提供了基礎(chǔ)。 方法：本實驗以rAAV2／hFIX按1×10<'13>v.g／kg的劑量結(jié)腸灌注給昆明小鼠／血友病B小鼠實驗組小鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠血漿中的抗rAAV2抗體，改進(jìn)型Bethesda法檢測小鼠血漿中的中和抑制性抗體(抗hFIX抗體)，采用PCR技術(shù)以及免疫組化檢測hFIX目的基因在實驗組小鼠的心，肝，脾，肺，

3、腎，結(jié)腸，腦，卵巢組織中的分布，行局部病理切片，了解結(jié)腸黏膜的病理改變。 結(jié)果：1．rAAV2／hFIX灌腸后，第14天昆明小鼠血漿中能夠檢測出rAAV2的IgG抗體；第21天達(dá)到峰值，為(10.05±0.80)；此后逐漸下降，第35天，IgG抗體水平仍是灌腸前的3倍左右；血友病B小鼠的血漿中第14天和21天分別為(8.30±0.80)和(9.40±0.60)，與昆明小鼠的IgG抗體水平相當(dāng)。2．rAAV2／hFIX灌腸后，第7

4、天實驗組昆明小鼠血漿中可檢測到小鼠血漿中的中和抑制性抗體(抗hFⅨ抗體);第14天達(dá)到峰值,為(19.3±1.8)B.U/ml;此后迅速下降,但是到第28至35天中和抑制性抗體(抗hFⅨ抗體)水平下降速度趨緩,仍然有7-8 B.U/ml左右。3.實驗組血友病B小鼠的心,肝,脾,肺,腎,結(jié)腸,腦,卵巢組織DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,其產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示:在結(jié)腸組織所在的泳道中可見約183bp的DNA條帶,DNA測序分析顯示,在結(jié)腸組織中確實含有h

5、FIX基因,但其他組織未擴(kuò)增出hFⅨ基因。在灌腸后第21天血友病B小鼠實驗組免疫組化檢測鏡檢顯示:結(jié)腸黏膜下層被染成深棕色,黏膜層不明顯。4.在灌腸后第21天血友病B小鼠實驗組HE染色玻片鏡檢顯示結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常,無水腫,無炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)論:灌腸途徑給予血友病B小鼠/昆明小鼠rAAV2/hFⅨ后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗重組腺相關(guān)病毒的抗體和中和抑制性抗體(抗hFⅨ抗體);目的基因僅分布在結(jié)腸組織中,沒有擴(kuò)散到其他組織;小鼠結(jié)腸局部