銀杏酸(15：1)的代謝及毒性研究.pdf

1、銀杏用于傳統(tǒng)中醫(yī)已有數(shù)千年的歷史，主要用來治療血液循環(huán)障礙，增強(qiáng)記憶能力。由于銀杏含有多種活性化學(xué)成分，導(dǎo)致銀杏具有廣泛的藥理活性和毒性作用。銀杏酸是一類水楊酸的衍生物，是廣泛存在于銀杏葉、果和外種皮中的生物活性成分，以外種皮中的含量為最高。銀杏酸被確認(rèn)為有害化合物，具有的細(xì)胞毒性、致敏、致突變和致癌的特性。近年來，國(guó)際上用銀杏酚酸作為銀杏藥物半成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中一個(gè)重要控制指標(biāo)，要求銀杏酚酸含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))控制在百萬分之五以下。對(duì)于銀杏酸

2、的研究多集中在藥理和毒理方面，而對(duì)于體內(nèi)外代謝及其代謝物研究還沒有相關(guān)報(bào)道。
　　 在本研究中，從銀杏外種皮中提取、分離并制備了GA(15:1)。在體外代謝研究中，應(yīng)用SD大鼠的肝微粒體考察了其代謝情況。通過超高效液相色譜/二極管陣列檢測(cè)器/負(fù)離子電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-PDA-ESI-MSIMS)和氫/氘(H/D)交換的方法，對(duì)l相代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在代謝過程中，GA(15:1)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上沒有發(fā)生改變，氧化主要發(fā)

3、生在C6位的烷基側(cè)鏈上。與對(duì)照組相比，在PDA圖中至少有8個(gè)代謝產(chǎn)物，其中的6個(gè)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)得到了確證，并且都為新代謝物。
　　 本研究應(yīng)用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)了I相代謝能否夠增加GA(15:1)的肝臟毒性作用。通過對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的I相代謝酶CYPIA和CYP3A進(jìn)行化學(xué).抑制和對(duì)HepG2細(xì)胞的I相代謝酶CYPIA和CYP3A進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)，采用MTT法評(píng)估給予GA(15:1)后細(xì)胞的存活率。結(jié)果表明，在兩種細(xì)胞中，GA

4、(15:1)的細(xì)胞毒作用都呈時(shí)間濃度依賴關(guān)系，其中，對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞的毒性明顯小于對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)4天后，細(xì)胞對(duì)GA(15:1)敏感性比只培養(yǎng)20h的原代肝細(xì)胞小很多。同時(shí)給予GA(15:1)和選擇性CYPP450酶抑制劑，a-萘黃酮(CYP1A)或酮康唑(CYP3A)，大鼠原代肝細(xì)胞對(duì)GA(15:1)毒性作用的敏感性明顯降低。用選擇性CYPP450酶誘導(dǎo)劑， B.萘黃酮(CYPIA)或利福平(CYP3A)，預(yù)

5、處理HepG2細(xì)胞3天后給予GA(15:1)，可明顯提高GA(15:1)對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用。這些結(jié)果表明，與大鼠原代肝細(xì)胞相比，GA(15:1)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有更大的細(xì)胞毒作用，并且CYPIA和CYP3A的代謝能夠增加GA(15:1)的細(xì)胞毒作用。
　　 銀杏酸已被證明具有致過敏、遺傳毒性和細(xì)胞毒性等活性。然而，關(guān)于P.糖蛋白(P-gp)的外排作用是否能夠降低銀杏酸在腎臟中的毒性作用；銀杏酸的腎小管上皮細(xì)胞毒性機(jī)

6、制是導(dǎo)致細(xì)胞壞死還是凋亡等還沒有相關(guān)報(bào)道。在本研究中，應(yīng)用MDCK細(xì)胞考察了GA(15:1)的腎毒性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GA(15:1)在MDCK細(xì)胞和MDCK- MDR1細(xì)胞上的毒性具有時(shí)間濃度依賴關(guān)系，并且對(duì)MDCK- MDR1細(xì)胞的毒性小于對(duì)MDCK細(xì)胞，這與GA(15:1)在MDCK-MDR1細(xì)胞內(nèi)的積聚量小于在MDCK細(xì)胞內(nèi)積聚量可能有一定關(guān)系。應(yīng)用P-糖蛋白抑制劑如維拉帕米或環(huán)孢菌素A預(yù)孵育15 min，能夠增加GA(15:1)在MD

7、CK- MDR1細(xì)胞內(nèi)的積聚，明顯增加GA(15:1)對(duì)MDCK-MDR1細(xì)胞的毒性，這間接說明腎臟中的P-gp能夠外排GA(15:1)，降低其腎毒性。
　　 為了研究GA(15:1)細(xì)胞毒作用是導(dǎo)致細(xì)胞壞死還是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，明確其在MDCK細(xì)胞的毒性作用機(jī)制，采用了DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究.結(jié)果表明，在高濃度短時(shí)間內(nèi)，GA(15:1)能夠直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死；在低濃度長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，也沒有發(fā)現(xiàn)GA(15:1)有誘