柿SSR富集DNA文庫構(gòu)建與篩選.pdf

1、柿(DiospyrosKakiThunb)是我國廣泛栽培的果樹之一，其面積和產(chǎn)量位于世界第一。柿原產(chǎn)中國，資源豐富，在國際上有一定優(yōu)勢。位于西北農(nóng)林科技大學(xué)的國家柿種質(zhì)資源圃收集有560多份材料或品種，這些材料中除部分日本甜柿通過雜交育成，譜系及親緣關(guān)系比較清楚外，其他種質(zhì)遺傳背景不清。要想從更深層次上發(fā)掘和利用這些資源，就必須找到一個強有力的進(jìn)行種質(zhì)分析的工具。分子標(biāo)記中的微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記具有多態(tài)性豐富，重復(fù)性好，共顯性等優(yōu)點

2、，是目前最重要的分子標(biāo)記之一；但SSR標(biāo)記必須采用特異性的引物才能進(jìn)行PCR檢測。柿屬于柿科柿屬，關(guān)于柿的SSR標(biāo)記，即SSR標(biāo)記的特異性引物目前尚無報道，也沒有相近物種的SSR標(biāo)記可供轉(zhuǎn)移使用，因而必須自己開發(fā)引物，而構(gòu)建SSR富集DNA文庫是快速開發(fā)SSR引物的基礎(chǔ)。 該試驗研究首次構(gòu)建了柿SSR富集DNA文庫，創(chuàng)建了適合柿基因組DNA的SSR引物開發(fā)體系。其方法是：將柿基因組DNA經(jīng)酶切后轉(zhuǎn)變成AFLPDNA片段，然后用生

3、物素標(biāo)記的簡單重復(fù)序列(SSR)作探針與其雜交，雜交復(fù)合物固定到包被有鏈霉親和素的磁珠上，經(jīng)過一系列的洗滌過程，含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。這些片段經(jīng)洗脫下來后，先用對應(yīng)的AFLP引物擴增，再用pGEM-TEasyVector體系進(jìn)行克隆，初步用白色/藍(lán)色克隆表現(xiàn)型進(jìn)行預(yù)選，挑選表現(xiàn)為白色的克隆，構(gòu)建SSR富集DNA文庫。文庫的進(jìn)一步篩選采用ColonyPCR技術(shù)，避免了使用同位素標(biāo)記雜交選擇。其主要結(jié)果是： 1、

4、建立了適合柿基因組DNA提取的改良CTAB法，得到的基因組DNA純度高、質(zhì)量好、完整，相對分子量大(MolecularWeight≈21.23kb)，通過定量稀釋，濃度約為100ng/μl。 2、以柿為材料建立了EcoRI/MseI雙內(nèi)切酶酶切、AFLP預(yù)擴增體系， 3、建立了用SSR生物素標(biāo)記探針與基因組DNA的AFLP片段雜交、用磁珠富集法分離微衛(wèi)星DNA片段的體系。 4、首次構(gòu)建了柿SSR富集DNA文庫及C