基因工程改造小球藻提高其蝦青素表達量.pdf

1、蝦青素是一種次生類胡蘿卜素，具有超強的抗氧化性，在生物體內能淬滅單線態(tài)氧、清除自由基，可以防止機體衰老，增強免疫力。同時還具有抗癌抑癌、預防心血管疾病等生物學功能，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和保健品等行業(yè)。小球藻含有蝦青素，具有生長速度快、生物密度高、易培養(yǎng)等優(yōu)點，是很好的生物反應器。但是小球藻中蝦青素含量低，應用基因工程的方法提高蝦青素含量成為近年來研究的熱點。
　　農桿菌具有操作簡單、轉化效率高、經濟實用等優(yōu)點，近年來廣泛應用于藻類

2、的遺傳轉化。本研究建立農桿菌介導的小球藻遺傳轉化的方法，構建β-胡蘿卜素酮化酶基因表達載體，并通過農桿菌介導的方法轉入小球藻中，提高蝦青素含量。本論文具體研究內容和成果如下:
　　1、篩選體系的確定:研究羧芐青霉素對農桿菌和小球藻的影響，羧芐青霉素濃度為200mg/L時抑制農桿菌的生長，羧芐青霉素對小球藻生長無影響。研究小球藻在BBM液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中對G418的敏感性，確定在BBM液體培養(yǎng)中G418的篩選濃度為1mg/L;

3、在BBM固體培養(yǎng)基中G418的篩選濃度為2mg/L。最終確定BBM液體培養(yǎng)基中G418濃度為1mg/L和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系;在固體培養(yǎng)基中G418濃度為2mg幾和羧芐青霉素濃度為500mg/L的小球藻篩選體系。
　　2、以GFP為報告基因，以G418抗性基因（NPTⅡ）作為篩選標記基因，CaMV35S為啟動子，PBI121為載體，利用農桿菌介導轉化的方法，建立小球藻遺傳轉化體系。通過PCR驗證，GFP基

4、因在小球藻內完成基因重組;通過RT-PCR驗證，GFP基因成功轉錄;在激光共聚焦下轉化子顯示綠色熒光，GFP基因成功翻譯。轉化200天后，陽性鑒定依然為陽性，GFP穩(wěn)定遺傳表達。
　　3、構建PBI121∷35S∷PDSSP-BKT載體。PDSSP為調控八氫番茄紅素的信號肽基因，BKT為β-胡蘿卜素酮化酶基因，先通過overlap PCR技術克隆獲得PDSSP-BKT融合基因。
　　4、利用農桿菌介導轉化的方法，將PDSSP