海水淹溺肺損傷肺水通道蛋白1、5的表達及意義的實驗研究.pdf

1、海水淹溺不僅是航海事故、海上生產(chǎn)作業(yè)、旅游的死亡原因之一，而且是軍隊海上訓練、作戰(zhàn)、搶灘登陸戰(zhàn)斗和非戰(zhàn)斗減員的重要原因。水運交通事故，潛水等水上運動引起的淹溺在沿海地區(qū)更為常見。海水吸入肺內(nèi)，可以直接損傷肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞和肺毛細血管內(nèi)皮細胞，也可以激發(fā)肺部急性炎癥反應，引起肺水腫，急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)主要介導自由水跨生物膜轉(zhuǎn)運，對保持細胞內(nèi)外環(huán)境

2、的穩(wěn)態(tài)平衡起重要作用，也參與執(zhí)行機體的一些重要生理功能。水通道蛋白(AQPs)在肺泡毛細血管間的水跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用，在調(diào)節(jié)肺泡上皮細胞的液體清除中已受到高度重視。AQPs與肺組織液體轉(zhuǎn)運密切相關，在肺水平衡調(diào)節(jié)上有重要作用。但是水通道蛋白在海水淹溺性肺損傷中的作用仍不甚清楚，在海水引起的肺損傷中，AQP1，5有什么變化，起什么作用，這方面的研究也較少。為此，在本研究中，我們以海水浸泡A549細胞和海水淹溺性肺損傷大鼠動物模型為研究

3、對象，觀察AQP1，5在A549細胞內(nèi)和肺組織的表達情況，以及地塞米松干預后的變化規(guī)律，同時觀察肺組織的炎癥反應的變化規(guī)律，旨在探討海水型急性肺損傷(SW-ALI)/海水型呼吸窘迫綜合征(SW-RDS)狀態(tài)下，肺組織內(nèi)AQP1，5的動態(tài)變化規(guī)律及其在肺水腫中的作用。 研究內(nèi)容： 1.應用MTT法、光鏡、免疫熒光和PT-PCR法檢測海水對肺腺癌系細胞A549生長曲線、生長抑制率、細胞形態(tài)的影響及AQP1和AQP5在mRNA

4、和蛋白水平的表達情況。 2.130只健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組，即海水淹溺組(n=60)、地塞米松處理組(n=10)和對照組(n=60)。海水淹溺組大鼠行氣管切開、插管、吸入海水法建立；對照組大鼠只行氣管切開，氣管插管；地塞米松處理組大鼠，吸入海水同時給予腹腔內(nèi)注射地塞米松(1mg/kg)。各組大鼠分別于致傷后0.5h、1h、2h、4h、8h時間點，取大鼠頸動脈血做血氣分析觀察動脈血氧分壓(PaO2)的變化；光鏡下觀察

5、肺組織病理變化；ELISA法測定外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的含量；伊文思蘭法測定肺組織通透性變化。 3.分別采用免疫組織化學法和RT-PCR方法檢測肺組織中AQP1，5表達與蛋白分布。 結果： 1.肺腺癌細胞A549經(jīng)海水浸泡15分鐘后光鏡下可見到細胞膜皺縮，細胞變小，但未見到細胞器及胞膜破裂。海水浸泡(1，2，4，8，16min)后，24小時內(nèi)A549細胞生長受到抑制，但24

6、小時后兩組間無顯著差異(P＞0.05)。 2.海水浸泡組A549細胞AQP1在mRNA和蛋白水平表達(0.78±0.07，27.3±2.7)明顯高于對照組(0.41±0.04，18.6±1.5)(P＜0.01；P＜0.05)。 3.A549細胞AQP5mRNA和蛋白的表達海水浸泡組(0.53±0.06，36.9±4.4)明顯高于對照組(1.07±0.13，51.3±6.2)(P＜0.01；P＜0.05)。 4.海

7、水吸入后，大鼠動脈血氧分壓(PaO2)和PaO2/FiO2迅速下降，0.5小時時下降最為明顯(42.4±6.4，202.2±30.5)，以后逐步上升，各時相點(0.5，1，2，4，8h)海水吸入組明顯低于對照組(P＜0.01)；PaCO2僅在0.5h時有輕度增高(43.1±4.2)；HCO3下降迅速，在2h時達到最低點(8.3±4.6)；pH在1h時下降到最低點(7.13±0.03)。 5.光鏡下可見海水淹溺組大鼠各時點肺組織有

8、毛細血管充血、肺間隔增寬、肺間質(zhì)、肺泡水腫和灶性出血，肺泡腔可見大量紅細胞，8小時組最為明顯，對照組未見明顯病理變化。 6.大鼠外周血TNF-α，在吸入海水后迅速增加，1小時即達到328.23±34.68pg/ml，2小時340.24±30.25pg/ml，之后逐步下降，海水吸入組各時相點明顯高于對照組(P＜0.01)。 7.大鼠外周血IL-6，在吸入海水后逐步增加，在8小時達最大(1106.4±180.6pg/ml)。

9、海水吸入組各時相點明顯高于對照組(P＜0.01)。 8.大鼠肺毛細血管通透性海水吸入后明顯增大(30.7±2.9μg/ml)，顯著高于對照組(18.4±1.7μg/ml)(P＜0.01)。 9.大鼠肺濕/干比值(W/D)吸入海水后明顯增大，在實驗時間內(nèi)逐步增加，8小時時最高(5.86±0.43)，與相應時相對照組(4.46±0.37)比較有顯著差異(P＜0.01)。 10.海水淹溺組及對照組大鼠肺間質(zhì)的毛細血管內(nèi)

10、皮AQP1均呈陽性表達；但海水淹溺組表達更強，光密度積分值顯著高于對照組的表達(P＜0.05)；海水淹溺組大鼠肺組織AQP1mRNA表達也顯著高于對照組(P＜0.01)。 11.海水淹溺組大鼠肺實質(zhì)AQP5的陽性表達，積分光密度值顯著高于對照組的表達(P＜0.05)；海水淹溺組大鼠肺組織AQP5mRNA表達也顯著高于對照組(P＜0.01)。 12.地塞米松處理組大鼠，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的釋放、肺泡和肺間質(zhì)水腫、

11、W/D、明顯低于海水淹溺組，仍然高于對照組；PaO2及PaO2/FiO2明顯高于海水淹溺組；肺組織AQP1，5的表達積分光密度值顯著高于海水淹溺組(P＜0.05)；肺組織AQP1，5mRNA表達也顯著高于海水淹溺組(P＜0.01)。 結論： 1.海水浸泡對A549細胞有損傷作用，但短時間內(nèi)(16min)無致死作用。 2.海水浸泡可使A549細胞細胞變小，胞膜皺縮，細胞內(nèi)水外滲，同時并存AQP1，5表達上調(diào)，表明A

12、QP1，5參與細胞內(nèi)外的水平衡調(diào)節(jié)。 3.海水吸入肺內(nèi)可引起大鼠炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的釋放增多，肺泡、肺間質(zhì)水腫，PaO2和PaO2/FiO2下降，表明海水淹溺可引起急性肺損傷。 4.海水淹溺所致大鼠肺損傷時，隨肺水腫加重，AQP1和AQP5mRNA及蛋白表達顯著上調(diào)，表明AQP1和AQP5可能與肺水腫的形成過程有關。 5.地塞米松可以改善海水淹溺ALI大鼠肺的毛細血管通透性、肺濕干比值、炎性因子的釋放，