外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的磁粒子標(biāo)記和MR成像研究.pdf

1、第一部分：兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定的實驗研究 目的：探討新西蘭大白兔外周血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 方法：用密度梯度離心法從新西蘭兔外周血中分離出單個核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，通過貼壁篩選得到EPCs，從細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、免疫化學(xué)、熒光染色、流式細(xì)胞儀分析表面標(biāo)記物及RT-PC

2、R檢測mRNA等方面鑒定EPCs，應(yīng)用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：新西蘭兔外周血分離得到的MNCs經(jīng)體外培養(yǎng)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，電鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞特征性WP小體，表達(dá)EPCs的表面標(biāo)志物CD34、CD105、CD106和VEGFR2等，表達(dá)VEGFR2、eNOs和vWF的mRNA，顯示內(nèi)吞乙?；兔芏戎鞍?acLDL)、結(jié)合凝集素1(UEA-1)等內(nèi)皮細(xì)胞的功能特性，提示培養(yǎng)細(xì)胞具有EP

3、Cs的形態(tài)、功能和表面蛋白特性；培養(yǎng)18天后，平均可從1ml血中獲得(3．09±0．51)×105個細(xì)胞，原代細(xì)胞傳代后第2～5天生長迅速，細(xì)胞周期分析示超過90％處于G0／G1期，早期凋亡為11．67±1．18％。 結(jié)論：兔外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs，可通過密度梯度離心法分離得到，具有干細(xì)胞特性，可體外培養(yǎng)、分化為內(nèi)皮細(xì)胞。 第二部分：外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞磁粒子標(biāo)記及MR體外成像研究 目的：應(yīng)用納米磁粒

4、子的偶聯(lián)物Fe2O3-PLL體外標(biāo)記兔外周血內(nèi)皮徂細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)，磁共振對標(biāo)記細(xì)胞成像。 方法：制備Fe2O3-PLL，分離兔外周血單個核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，貼壁法篩選出EPCs，傳代培養(yǎng)，標(biāo)記Fe2O3-PLL，普魯士蘭染色、電子顯微鏡顯示細(xì)胞內(nèi)鐵，四氮噻唑藍(lán)(MTT)比色試驗評價不同濃度Fe2O3-PLL標(biāo)記EPCs后對細(xì)胞生長的影響，選

5、取適當(dāng)?shù)臉?biāo)記濃度，顯微鏡下觀察Fe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞的最佳孵育時間及標(biāo)記率，原子吸收光譜分析定量細(xì)胞內(nèi)鐵，應(yīng)用MR的不同序列進(jìn)行體外細(xì)胞群成像。 結(jié)果：普魯士蘭染色顯示藍(lán)色鐵顆粒位于細(xì)胞漿內(nèi)，電鏡觀察細(xì)胞核周圍的胞漿內(nèi)存在大量納米磁粒子；MTT比色試驗示10μg／ml至200μg／ml7個鐵濃度組，F(xiàn)e2O3-PLL標(biāo)記后細(xì)胞的光吸收值與未標(biāo)記者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)，采用低鐵濃度(20μg／ml～30μg／m

6、l)標(biāo)記較為合適，在此濃度下孵育(18～24)h即可有效標(biāo)記細(xì)胞，標(biāo)記率接近100％；原子吸收光譜分析示隨著標(biāo)記后培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞內(nèi)鐵含量降低；MRI顯示標(biāo)記Fe2O3-PLL的細(xì)胞群較未標(biāo)記者信號降低，以T2*WI信號強(qiáng)度變化率最大(P<0．05)，標(biāo)記后培養(yǎng)7d的信號強(qiáng)度變化率均較標(biāo)記1d者下降(P<0．05)。 結(jié)論：低鐵濃度Fe2O3-PLL即可有效標(biāo)記兔外周血EPCs，隨著標(biāo)記后培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞內(nèi)納米鐵減少，臨

7、床應(yīng)用型1．5TMR可在體外進(jìn)行標(biāo)記細(xì)胞群成像。 第三部分：Fe2O3-PLL標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞對細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實驗研究 目的：應(yīng)用自行合成的超順磁性納米鐵粒子復(fù)合物Fe2O3-PLL標(biāo)記新西蘭免外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)，探討其對細(xì)胞增殖、功能、分化等生物學(xué)特性的影響。 方法：合成Fe2O3-PLL復(fù)合物。分離兔外周血單個核細(xì)胞(mononuclearc

8、ells,MNCs)，貼壁法篩選出EPCs，F(xiàn)e2O3-PLL標(biāo)記EPCs，電子顯微鏡顯示細(xì)胞內(nèi)鐵及內(nèi)皮細(xì)胞的特征性小體Weibel-Palade小體，四氮噻唑藍(lán)(MTT)比色試驗比較未標(biāo)記細(xì)胞與25ug／mlFe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞后生長曲線的差異，流式細(xì)胞分析檢測標(biāo)記、未標(biāo)記細(xì)胞的表面標(biāo)記物表達(dá)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，NO、NOS檢測試劑盒分析未標(biāo)記、標(biāo)記后培養(yǎng)不同時間細(xì)胞的NO含量、NOS活性差異，激光共聚焦顯微鏡下觀察并分析

9、Fe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞后對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及膜流動性的影響情況，RT-PCR檢測未標(biāo)記、標(biāo)記后培養(yǎng)1、7天細(xì)胞的VEGFR2、eNOS、vWF的mRMA表達(dá)情況。 結(jié)果：電鏡觀察示鐵顆粒及WP小體位于細(xì)胞漿內(nèi)；MTT比色試驗示25ug／mlFe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞，其生長曲線與未標(biāo)記細(xì)胞的相似；流式細(xì)胞分析顯示25ug／mlFe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞未改變其表面標(biāo)記物(CD34、CD146、VEGFR2)的表達(dá)，標(biāo)記細(xì)胞的

10、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與未標(biāo)記細(xì)胞相似；NO、NOS檢測分析結(jié)果顯示未標(biāo)記細(xì)胞與標(biāo)記后培養(yǎng)1、2、3、5、7天細(xì)胞的NO含量、NOS活性間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0．05)：激光共聚焦顯微鏡分析示Fe2O3-PLL標(biāo)記細(xì)胞不改變細(xì)胞內(nèi)外鈣離子平衡及細(xì)胞膜流動性；未標(biāo)記細(xì)胞、標(biāo)記后培養(yǎng)1、7天細(xì)胞的VEGFR2、eNOS、vWF的mRNA表達(dá)量間無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：低標(biāo)記濃度(25ug／ml)的Fe2O3-PLL即可有效標(biāo)記兔外周血EPC

11、s，其對細(xì)胞的增殖、功能、分化等生物學(xué)特性無明顯影響，可用于進(jìn)一步的活體示蹤實驗。 第四部分:兔頸動脈粥樣硬化模型的MR成像及內(nèi)皮祖細(xì)胞磁粒子標(biāo)記后經(jīng)股動脈插管局部移植、MR示蹤的初步實驗研究 目的：高脂飲食加球囊擴(kuò)張右側(cè)頸動脈制作新西蘭兔動脈粥樣硬化模型，應(yīng)用1．5T臨床應(yīng)用型磁共振觀測動脈粥樣硬化形成過程，探討納米磁粒子偶聯(lián)物Fe2O3-PLL標(biāo)記兔外周血LEPCs，經(jīng)股動脈插管同種異體移植到模型兔右側(cè)頸動脈局部、活

12、體成像的可行性。 方法：制備Fe2O3-PLL，標(biāo)記分離純化后得到的兔外周血EPCs，普魯士蘭染色顯示細(xì)胞內(nèi)鐵：高脂飲食加球囊擴(kuò)張右側(cè)頸動脈制作新西蘭兔動脈粥樣硬化模型，于球囊擴(kuò)張前及擴(kuò)張后2、4、8、12周取靜脈血檢測血脂改變情況，同時進(jìn)行頸部MR成像及頸動脈病理學(xué)檢查。同種方法制作模型兔18只，分為標(biāo)記細(xì)胞移植組(n=6)、未標(biāo)記細(xì)胞移植組(n=6)和對照組(n=6)。模型制作6周后，將標(biāo)記細(xì)胞、未標(biāo)記細(xì)胞及等量生理鹽水經(jīng)股

13、動脈插管移植至模型兔右側(cè)頸動脈局部，在移植前、移植后1d、7d、14d應(yīng)用MR對頸動脈進(jìn)行活體成像。觀察血管管壁及管腔的變化情況，測量頸部血管的對比度噪聲比(CNR)及血管腔內(nèi)信噪比(SNR)，細(xì)胞移植后每一時間點進(jìn)行血管組織切片的普魯士蘭染色。 結(jié)果：普魯士蘭染色顯示藍(lán)色鐵顆粒位于EPCs胞漿內(nèi)，F(xiàn)e2O3-PLL對EPCs的標(biāo)記率接近100％；高脂飲食后第2、4、8、12周血漿膽固醇、甘油三酯水平進(jìn)行性增加；MR成像顯示：與

14、高脂喂養(yǎng)前相比，血管壁在高脂喂養(yǎng)后4周(球囊擴(kuò)張后3周)時可見增厚，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．001)，血管腔在高脂喂養(yǎng)8周后可見狹窄，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0．05)；增厚的血管壁于各成像序列上均呈不均勻高信號，頸部CNR測量結(jié)果顯示質(zhì)子密度加權(quán)像(PDWI)的CNR最高，最利于頸部血管的顯示，血管腔內(nèi)的SNR測量結(jié)果亦顯示PDWI的SNR最高，成像質(zhì)量最好。病理學(xué)檢測示高脂喂養(yǎng)、球囊損傷后內(nèi)膜破壞、血管平滑肌增厚，至第12周時，可見典