系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的研究.pdf

1、目的:硬皮病是以局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟器官結(jié)締組織的纖維化或硬化,最后發(fā)生萎縮為特點(diǎn)的疾病。按累及的范圍的不同分為局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma,SSc)。它的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,病因可能與遺傳、性別和環(huán)境因素有關(guān),發(fā)病機(jī)制多認(rèn)為與血管病變、自身免疫學(xué)說、膠原過程異常等有關(guān)。其中微血管系統(tǒng)病變被認(rèn)為是硬皮病發(fā)病的始動因素之一。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitorscel

2、ls,EPCs)也被稱為成血管細(xì)胞,是血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)的前體細(xì)胞,當(dāng)機(jī)體血管損傷時,它能聚集到該區(qū)域促進(jìn)血管新生。國外已有研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬皮病患者均存在不同程度的血管生成障礙,其外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量低于正常人。本文的研究目的旨在通過比較健康人與系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和增殖、遷移、黏附功能,來探討血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病的關(guān)系,為明確硬皮病的病因病機(jī)提供新的

3、線索,為尋找硬皮病的治療新方法提供理論依據(jù),從而減輕激素及免疫抑制劑帶給系統(tǒng)性硬皮病患者的不良反應(yīng),對延緩系統(tǒng)性硬皮病患者的病情進(jìn)展,改善患者的生活質(zhì)量起到一定作用。方法:隨機(jī)選取我院皮膚科門診和住院部診斷明確的20例系統(tǒng)性硬皮病患者作為實(shí)驗(yàn)組,本院門診體檢的20例健康人作為對照組。在無菌條件下采集各組受試者外周血(peripheral blood,PB)10ml,用肝素抗凝,在室溫下的水平離心機(jī)內(nèi),采用密度梯度離心法分離出單個核細(xì)胞(

4、Mononuclear cells,MNCs)并且計(jì)數(shù)。然后將上述分離的單個核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞貼壁以后就誘導(dǎo)其分化生長,同時每天將細(xì)胞放在倒置相差顯微鏡高倍鏡下觀察,并用相機(jī)拍照記錄下細(xì)胞的生長情況。采用DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)和FITC標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)染色,熒光顯微鏡觀察顯示桔黃色熒光的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測FITC-CD133+、PE-CD34+或FITC-CD13

5、3+、PerCP／Cy5.5-VEGFR2+雙熒光標(biāo)記鑒定的內(nèi)皮祖細(xì)胞。采用MTT比色法,在自動酶標(biāo)儀上選490nm波長測各孔的吸光度值(Opticaldensity,OD),分別以培養(yǎng)72小時后檢測的吸光度值為實(shí)驗(yàn)值,培養(yǎng)24小時檢測的吸光度值為對照值,按照以下公式計(jì)算:增殖率=[(OD實(shí)驗(yàn)值)／(OD對照值)-1]×100％,以觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力。采用millicell小室和黏附能力測定實(shí)驗(yàn),分別觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和黏附能力

6、。最后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±方差((x)±s)表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果:體積較小的圓形細(xì)胞為新鮮分離的單個核細(xì)胞,懸浮在培養(yǎng)液中。單個核細(xì)胞在48小時后體積開始增大并且貼附在培養(yǎng)瓶瓶壁上。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)了4-5天后便有了明顯地增殖,部分細(xì)胞于是就形成周圍為放射狀排列的長梭形細(xì)胞,的中心為圓形細(xì)胞細(xì)胞集落。經(jīng)過7天的培養(yǎng)有的長梭形細(xì)胞呈網(wǎng)格樣生長,有的線形生長,排列成鵝卵石樣。熒光顯微鏡下觀察到

7、DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞顯示桔黃色熒光,即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組同時表達(dá)FITC-CD133+、PE-CD34+或FITC-CD133+、PerCP／Cy5.5-VEGFR2+的細(xì)胞所占比例為0.10％±0.09％,與對照組0.49％±0.09％相比,P值小于0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量較健康者減少。實(shí)驗(yàn)組外周血EPCs增殖率為13.01±4.33％,

8、對照組為23.28±4.34％；兩組相比,P值小于0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組外周血EPCs增殖能力較對照組低下。實(shí)驗(yàn)組遷移到millicell小室底層的EPCs為(7.20±3.67)個／視野,對照組為(14.15±2.98)個／視野；兩組相比,P值小于0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組外周血EPCs遷移能力較對照組低下。實(shí)驗(yàn)組貼壁的EPCs為(15.20±4.40)個／視野,對照組為(24.80±3.58)個／視野；兩組比較,P值<0

9、.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)組EPCs黏附能力較對照組有所下降。結(jié)論:系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少,增殖、遷移和黏附功能降低?；颊吆徒】嫡弑容^,患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量較少,P值<0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力下降,黏附能力低下,遷移能力減退,三者的P值均<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果一方面證實(shí)了在系統(tǒng)性硬皮病中出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷的病理表現(xiàn),另一方面也提示我們可以通過增加外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量