系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內皮祖細胞數量和功能的研究.pdf

1、目的:硬皮病是以局限性或彌漫性皮膚及內臟器官結締組織的纖維化或硬化,最后發(fā)生萎縮為特點的疾病。按累及的范圍的不同分為局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬皮病(systemic scleroderma,SSc)。它的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚,病因可能與遺傳、性別和環(huán)境因素有關,發(fā)病機制多認為與血管病變、自身免疫學說、膠原過程異常等有關。其中微血管系統(tǒng)病變被認為是硬皮病發(fā)病的始動因素之一。內皮祖細胞(endothelial progenitorscel

2、ls,EPCs)也被稱為成血管細胞,是血管內皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)的前體細胞,當機體血管損傷時,它能聚集到該區(qū)域促進血管新生。國外已有研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬皮病患者均存在不同程度的血管生成障礙,其外周血內皮祖細胞的數量低于正常人。本文的研究目的旨在通過比較健康人與系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內皮祖細胞數量和增殖、遷移、黏附功能,來探討血管內皮祖細胞與系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病的關系,為明確硬皮病的病因病機提供新的

3、線索,為尋找硬皮病的治療新方法提供理論依據,從而減輕激素及免疫抑制劑帶給系統(tǒng)性硬皮病患者的不良反應,對延緩系統(tǒng)性硬皮病患者的病情進展,改善患者的生活質量起到一定作用。方法:隨機選取我院皮膚科門診和住院部診斷明確的20例系統(tǒng)性硬皮病患者作為實驗組,本院門診體檢的20例健康人作為對照組。在無菌條件下采集各組受試者外周血(peripheral blood,PB)10ml,用肝素抗凝,在室溫下的水平離心機內,采用密度梯度離心法分離出單個核細胞(

4、Mononuclear cells,MNCs)并且計數。然后將上述分離的單個核細胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),當細胞貼壁以后就誘導其分化生長,同時每天將細胞放在倒置相差顯微鏡高倍鏡下觀察,并用相機拍照記錄下細胞的生長情況。采用DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)和FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)染色,熒光顯微鏡觀察顯示桔黃色熒光的細胞。流式細胞儀檢測FITC-CD133+、PE-CD34+或FITC-CD13

5、3+、PerCP／Cy5.5-VEGFR2+雙熒光標記鑒定的內皮祖細胞。采用MTT比色法,在自動酶標儀上選490nm波長測各孔的吸光度值(Opticaldensity,OD),分別以培養(yǎng)72小時后檢測的吸光度值為實驗值,培養(yǎng)24小時檢測的吸光度值為對照值,按照以下公式計算:增殖率=[(OD實驗值)／(OD對照值)-1]×100％,以觀察內皮祖細胞的增殖能力。采用millicell小室和黏附能力測定實驗,分別觀察內皮祖細胞的遷移和黏附能力

6、。最后采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0進行數據處理,實驗數據以均數±方差((x)±s)表示,組間均數比較采用t檢驗。結果:體積較小的圓形細胞為新鮮分離的單個核細胞,懸浮在培養(yǎng)液中。單個核細胞在48小時后體積開始增大并且貼附在培養(yǎng)瓶瓶壁上。當細胞培養(yǎng)了4-5天后便有了明顯地增殖,部分細胞于是就形成周圍為放射狀排列的長梭形細胞,的中心為圓形細胞細胞集落。經過7天的培養(yǎng)有的長梭形細胞呈網格樣生長,有的線形生長,排列成鵝卵石樣。熒光顯微鏡下觀察到

7、DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光標記的細胞顯示桔黃色熒光,即為內皮祖細胞。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)實驗組同時表達FITC-CD133+、PE-CD34+或FITC-CD133+、PerCP／Cy5.5-VEGFR2+的細胞所占比例為0.10％±0.09％,與對照組0.49％±0.09％相比,P值小于0.01,差異有統(tǒng)計學意義,系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內皮祖細胞數量較健康者減少。實驗組外周血EPCs增殖率為13.01±4.33％,

8、對照組為23.28±4.34％；兩組相比,P值小于0.01,有統(tǒng)計學意義,實驗組外周血EPCs增殖能力較對照組低下。實驗組遷移到millicell小室底層的EPCs為(7.20±3.67)個／視野,對照組為(14.15±2.98)個／視野；兩組相比,P值小于0.01,有統(tǒng)計學意義,實驗組外周血EPCs遷移能力較對照組低下。實驗組貼壁的EPCs為(15.20±4.40)個／視野,對照組為(24.80±3.58)個／視野；兩組比較,P值<0

9、.01,有統(tǒng)計學意義,實驗組EPCs黏附能力較對照組有所下降。結論:系統(tǒng)性硬皮病患者外周血內皮祖細胞數量減少,增殖、遷移和黏附功能降低?；颊吆徒】嫡弑容^,患者外周血中內皮祖細胞的數量較少,P值<0.01,有統(tǒng)計學差異；患者外周血內皮祖細胞的增殖能力下降,黏附能力低下,遷移能力減退,三者的P值均<0.01,差異有統(tǒng)計學意義。這一結果一方面證實了在系統(tǒng)性硬皮病中出現(xiàn)血管內皮損傷的病理表現(xiàn),另一方面也提示我們可以通過增加外周血內皮祖細胞的數量