Claudin-7與Slug在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、前言:Claudin-7是緊密連接蛋白Claudins的家族成員之一,參與維持細(xì)胞的極性和調(diào)節(jié)細(xì)胞間的滲透性,在食管癌和結(jié)腸癌中表達(dá)降低或缺失而在胃腺癌和卵巢癌中Claudin-7的表達(dá)較周?chē)＝M織反而升高,但無(wú)論其表達(dá)升高還是降低都與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。Slug是鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail超家族成員之一,小鼠Slug和Snail具有高度的同源性,在N末端都含有SNAG反式轉(zhuǎn)錄區(qū),C末端分別含有5個(gè)和4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn)表明Slu

2、g在雞和爪蟾胚胎特定區(qū)域可以啟動(dòng)EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化),并且通過(guò)與啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合抑制E-cadherin、Claudin-1等其他緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄。在脊椎動(dòng)物中Snail抑制Claudin-7的轉(zhuǎn)錄活性不僅依賴(lài)于鋅指區(qū)域,而且還依賴(lài)于N末端的SNAG反式轉(zhuǎn)錄區(qū),而Slug與Snail在N末端具有高度同源性,都含有SNAG反式轉(zhuǎn)錄區(qū),在人類(lèi)Claudin-7啟動(dòng)子含有7個(gè)E-box,為Slug的結(jié)合提供了位點(diǎn),那么本研究旨在

3、初步探討肺癌中Claudin-7和Slug的表達(dá)情況,及兩者表達(dá)的可能相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法:
　　 1、材料收集101例原發(fā)性肺癌組織(鱗癌52例,腺癌49例)和40例正常肺組織,另外30例新鮮肺癌組織及癌旁肺組織均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年8月至2010年5月外科手術(shù)切除標(biāo)本。
　　 2、主要試劑
　　 濃縮型兔抗人Claudin-7多克隆抗體(34-9100)購(gòu)自Invitrog

4、en公司,兔抗人Slug多克隆抗體(bs-1382R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
　　 3、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)免疫組織化學(xué)
　　 組織標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定,石蠟包埋,制成4gm切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫苯、水化后,采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(S-P法)檢測(cè)Claudin-7(1:200)和Slug(1:150)蛋白表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽(yáng)性染色,每張切片在400倍

5、鏡下觀察10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10％為1分,11％-50％為2分,50％-75％為3分,≥75％為4分;再按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)色為0,淡色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;最后按照乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí):“-”(0,1,2),“+”(3,4),“++”(6,8),“+++”(9,12)。結(jié)果判定:分?jǐn)?shù)≥3定為陽(yáng)性,＜3為陰性。
　　 (2)Western Blot
　　 將含80μg總蛋白的

6、組織裂解產(chǎn)物進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳后,50伏恒壓轉(zhuǎn)膜120分鐘,脫脂奶粉室溫封閉2h,經(jīng)TTBS沖洗3次,抗Claudin-7抗體(1:300)、抗Slug抗體(1:300)和抗β-actin抗體(1:200),4℃孵育過(guò)夜后,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育2h,TTBS洗三次后ECL發(fā)光。以β-actin為內(nèi)對(duì)照,以β-actin為內(nèi)對(duì)照,比較各條帶灰度值。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)分析軟件,對(duì)Claudin-7和Slug表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系用x2檢驗(yàn);Claudin-7和Slug表達(dá)的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,采用t檢驗(yàn)分析Western blot圖像灰度值。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組化肺癌組織中Claudin-7的表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿,少量定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核,在鱗癌和腺癌中的表達(dá)較正常肺組織明顯減弱。Slug表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,在鱗

8、癌和腺癌中的表達(dá)較正常肺組織明顯增高。兩者表達(dá)水平均與肺癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),并且Slug還與TNM分期呈正相關(guān),Claudin-7與Slug蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 2、Western blotClaudin-7在肺癌組織中的表達(dá)量明顯低于配對(duì)癌旁肺組織,而Slug在肺癌組織的表達(dá)卻顯著高于癌旁肺組織。
　　 結(jié)論:在肺鱗癌和腺癌中,Claudin-7與Slug的表達(dá)變化與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān),是判斷其生物