脆性X綜合征小鼠前額葉可塑性異常的機制研究.pdf

1、【目的】
　　探索FMR1KO小鼠突觸可塑性調節(jié)異常的機制以及如何恢復ACC區(qū)的可塑性，以期對進一步認識脆性X綜合癥的病理機制，發(fā)掘潛在的藥物治療新靶點。
　　【方法】
　　1、全細胞膜片鉗記錄
　　小鼠采用1-2％異氟醚麻醉，取腦。振動切片機橫向切取300μmACC腦片，室溫下置于混合氣飽和的人工腦脊液(ACSF)中，恢復1小時后進行實驗。在具有紅外線DIC系統(tǒng)的顯微鏡下觀察ACC第II/III層錐體神經元。A

2、CSF灌流液中加入100Mpicrotoxin，刺激電極放置于ACC第V層，記錄電極放置于ACC第II/III層，在錐體神經元中選取狀態(tài)良好的椎體神經元進行封接。記錄興奮性突觸后電流（EPSC）和LTP。LTP誘導方法：80次刺激，頻率2Hz，同時神經元鉗制于+30mV，然后恢復到基線記錄模式，鉗制電壓恢復在-70mV。記錄mEPSC時，灌流液中加入TTX，轉換為Gapfree記錄模式。
　　2、小鼠前額葉皮層神經元的原代培養(yǎng)

3、r>　　取孕18天胎鼠，在無菌條件下斷頭取腦置于盛有PBS液的平皿中剝去腦膜，取大腦皮層并剪碎，消化后反復吹打制備細胞懸液。接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第三天加入阿糖胞苷，以抑制非神經元細胞的繼續(xù)增長。SKF81297（5μM），DL-AP3（10μM)），和forskolin（5μM）在收集細胞前24小時分組加入培養(yǎng)基，收集細胞待用。
　　3、Westernblot檢測
　　采用常規(guī)腦組織樣本制備

4、方法制備ACC區(qū)組織樣品。培養(yǎng)神經元細胞膜蛋白的提取，采用細胞膜蛋白生物素試劑盒提取的方法，提取過程同過往文獻報道[1]。Westernblot檢測方法：將蛋白轉到NC膜上后，分別用mGluR5，GluR1，NR2A，NR2B，p-NR2B的一抗封閉各自分子量相應的條帶，孵育后，漂洗，加入二抗漂洗發(fā)光。曝光完成后，經顯影和定影，自來水沖洗，最后在室溫下晾干。用β-actin或cadherin作為標準定量分子，確定各個蛋白相對量的多少。<

5、br>　　4、行為學實驗
　　開場實驗裝置由曠場反應箱和數據自動采集和處理系統(tǒng)兩部分組成，實驗小鼠置于曠場的中央，記錄并分析它的運動情況。高架十字迷宮各有兩個對稱的開放臂和封閉臂，十字中間為正方形平臺。實驗小鼠逐個放于中央平臺后，記錄每個小鼠5min內進入開放臂或封閉臂的次數與時間，并計算進入兩臂的總次數。Morris水迷宮定位航行實驗歷時數天,每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間。

6、動物實驗小鼠在實驗前分別腹腔注射生理鹽水，DL-AP3和/或SKF81297，45分鐘后開始實驗。
　　【結果】
　　1、SKF81297和DL-AP3對FMR1基因敲除小鼠LTP的增強
　　我們用全細胞膜片鉗的方法對成年腦薄片的前扣帶回區(qū)II-III層錐體細胞的電生理活動進行記錄，采用突觸前電刺激誘導突觸后去極化的方法使神經元產生LTP并記錄。我們發(fā)現(xiàn)在FMR1WT小鼠，該腦區(qū)神經元產生了明顯的長時程增強現(xiàn)象。但在F

7、MR1KO小鼠，這種增強效應不明顯。我們發(fā)現(xiàn)，正常和敲除小鼠的LTP效應與各自的空白對照組相比沒有顯著性差異。接下來，我們檢測了D1受體激動劑應用組的LTP誘導情況，發(fā)現(xiàn)在D1受體激動劑SKF812975μM孵育十分鐘后，正常小鼠腦薄片誘導后的LTP效應明顯增強,說明激活D1受體能增強正常小鼠的LTP效應。而在FMR1KO小鼠，應用SKF81297沒有增強其誘導后的LTP效應，說明D1受體激動劑的LTP增強作用在FMR1基因敲除小鼠AC

8、C區(qū)是受損的。
　　我們在檢測同時使用D1受體激動劑和mGluR1受體拮抗劑對LTP誘導的影響時，發(fā)現(xiàn)SKF81297和DL-AP3共同孵育腦片十分鐘，能顯著增強正常小鼠的LTP效應，這種增強效應與單獨應用D1受體激動劑SKF81297的正常小鼠相比沒有顯著性差異。在FMR1基因敲除小鼠，同時使用D1受體激動劑和mGluR1受體拮抗劑，ACC區(qū)LTP效應與單獨使用D1受體激動劑有顯著性增強。
　　為了檢測合用SKF81297

9、和DL-AP3對FMR1KO小鼠LTP的增強效應是否來源于D1受體激動劑，我們在孵育的液體中同時加入D1受體抑制劑，發(fā)現(xiàn)這種LTP增強效應消失?？梢哉J為FMR1KO小鼠LTP的增強效應來源于D1受體激動劑，這種效應是由mGluR1受體拮抗劑恢復的。
　　2、腺苷酸環(huán)化酶激動劑恢復D1受體激動劑對FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP增強效應
　　為了確定增加腺苷酸環(huán)化酶的量是否能替代D1受體的作用，我們研究了腺苷酸環(huán)化酶激動劑for

10、skolin對FMR1KO小鼠ACC區(qū)LTP是否有增強作用。發(fā)現(xiàn)加入forskolin且有電刺激誘導的情況下，LTP的幅度與未使用forskolin的FMR1WT小鼠對照組相比無顯著性差異。與單獨使用forskolin的FMR1WT小鼠組相比，DL-AP3與forskolin結合使用并沒有引起FMR1WT小鼠LTP幅度增加。單獨使用Forskolin并電刺激誘導LTP的FMR1KO未產生明顯的LTP增強效應，而聯(lián)合使用forskolin

11、和DL-AP3的FMR1KO小鼠LTP有增強。
　　為了確定多巴胺能介導的LTP效應是否需要NMDA受體的激活，我們在灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP5，發(fā)現(xiàn)SKF81297介導的LTP增強效應消失。同樣，LTP增強效應在灌流液中加入10mMBAPTA后也被阻斷，表明多巴胺能介導的LTP效應需要NMDA受體的激活和突觸后鈣離子濃度增加的。
　　3、mGluR1受體介導的可塑性是經由突觸后機制產生的
　　我們檢測了AC

12、C區(qū)的雙脈沖易化(PPF)情況。在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)，灌流液中同時或分別加入DL-AP3和SKF81297前后，PPF的五個脈沖間隔產生的突觸后反應沒有顯著性差異。結果表明，突觸前遞質釋放沒有改變，mGluR1受體介導的可塑性很可能是經由突觸后機制產生的。
　　4、mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎谷氨酸能遞質釋放
　　我們檢測了ACC區(qū)AMPA受體介導的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)。在灌流液中同時或

13、分別加入DL-AP3和SKF81297，AMPA受體介導的微小興奮性突觸后電流在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)都沒有發(fā)生顯著性變化。表明mGluR1受體拮抗劑不影響突觸的基礎性谷氨酸能遞質釋放。
　　5、AMPA受體的表達
　　為了確定這種協(xié)同作用對AMPA受體的表達和上膜有何影響，我們在培養(yǎng)的PFC細胞中加入D1受體激動劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3。發(fā)現(xiàn)單獨使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-A

14、P3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元總的GluR1的表達。而在FMR1KO小鼠，單獨使用SKF81297或者DL-AP3都沒有改變培養(yǎng)神經元總的GluR1的表達。單獨使用SKF81297或者聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元AMPA受體在膜上的表達。SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元GluR1在膜上的表達。表明mGluR1受體恢復了D1受體激動劑對FMR1K

15、O小鼠PFC細胞AMPAGluR1受體在膜上表達的增強作用。
　　我們檢測了DL-AP3和forskolin對培養(yǎng)神經元GluR1向膜轉運過程的影響。發(fā)現(xiàn)單獨使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元總的GluR1的表達。單獨使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都沒有增加培養(yǎng)的FMR1KO小鼠PFC神經元總的GluR1的表達。而單獨使用Forskolin或聯(lián)合使用DL-AP3都會

16、增加培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元GluR1在膜上的表達。forskolin聯(lián)合使用DL-AP3增加了培養(yǎng)的FMR1WT小鼠PFC神經元GluR1受體在膜上的表達。表明D1受體激動劑SKF81297和mGluR1受體拮抗劑DL-AP3在FMR1KO小鼠上的聯(lián)合作用是通過抑制mGluR1受體，激活腺苷酸環(huán)化酶實現(xiàn)的。
　　6、mGluR5，D1受體和NMDA受體亞型在PFC培養(yǎng)神經元上的表達
　　通過Westernblot

17、檢測，發(fā)現(xiàn)mGluR5和D1受體以及NMDA受體的兩個亞型NR2A和NR2B受體在WT和FMR1KO小鼠ACC區(qū)的表達水平都沒有顯著性差異。因此，mGluR5和D1受體在ACC區(qū)突觸增強作用受損不是因為mGluR5和D1受體以及NR2A和NR2B受體的基礎表達水平差異引起的。且單獨使用SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都不影響NR2A和NR2B亞型在FMR1WT和KO小鼠PFC神經元上的表達。然而，單獨使用SKF8

18、1297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3都顯著性增加了NR2B亞型磷酸化位點Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1WT小鼠PFC培養(yǎng)神經元上的表達。同時，單獨使用SKF81297沒有增加NR2B亞型磷酸化位點Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經元上的表達。而SKF81297聯(lián)合使用DL-AP3能恢復SKF81297在FMR1KO小鼠PFC培養(yǎng)神經元上p-NR2B-T

19、yr1472的表達增加作用。
　　7、SKF81297與DL-AP3聯(lián)合效應對FMR1KO小鼠行為學的影響
　　通過行為學研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO小鼠的自發(fā)活動能力增加。腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1WT小鼠的自發(fā)活動的運動距離都沒有顯著性改變。然而，單獨腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP345分鐘后，F(xiàn)MR1KO小鼠自發(fā)活動的運動距離都有顯著性

20、降低。在模擬焦慮行為的高架十字實驗中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MR1KO與WT組小鼠以及單獨應用SKF81297或聯(lián)合使用DL-AP3組之間焦慮指標沒有顯著性差異，表明脆性X綜合癥模型小鼠沒有表現(xiàn)出焦慮樣行為，且焦慮樣行為很可能不是通過D1受體通路起作用的。.
　　小鼠每天單獨腹腔注射SKF81297或者SKF81297聯(lián)合使用DL-AP35周后，進行Morris水迷宮實驗。對此后4天FMR1KO和WT小鼠找到平臺所用時間分析發(fā)現(xiàn)，在第一天兩組

21、之間就有顯著性差異，F(xiàn)MR1KO組比WT組小鼠找到平臺所用時間長。單獨使用SKF81297或DL-AP3均不影響FMR1KO和WT小鼠找到平臺所用時間，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在前3天與同基因型組相比沒有顯著改變，而在第4天，F(xiàn)MR1KO小鼠與聯(lián)合用藥的FMR1KO小鼠組相比有顯著性差異，聯(lián)合使用SKF81297和DL-AP3在第四天顯著降低FMR1KO小鼠找到平臺所用時間。FMR1KO和WT小鼠在水迷宮實驗過程中的平均游

22、泳速度在組間沒有顯著性差異。
　　8、FMR1KO小鼠ACC區(qū)五羥色胺能突觸可塑性異常
　　為了明確FMR1KO小鼠ACC區(qū)除多巴胺系統(tǒng)外，其他有關突觸可塑性的遞質系統(tǒng)是否正常，我們檢測了5-HT2A系統(tǒng)在ACC區(qū)有關突觸可塑性的電生理學和分子生物學表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)使用5-HT2A受體拮抗劑的WT小鼠能增強LTP效應。然而，5-HT2A受體拮抗劑在FMR1KO沒有表現(xiàn)出對LTP的增強效應。電生理實驗表明，與多巴胺系統(tǒng)在FMR1